C9orf72 基因中的GGGGCC重復(fù)擴(kuò)增是額顳葉癡呆（FTD）和肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）最常見的遺傳原因，而且重復(fù)的非ATG翻譯導(dǎo)致二肽重復(fù)蛋白(DPRs)的產(chǎn)生。隨著靶向重復(fù)擴(kuò)增的潛在療法進(jìn)入臨床試驗(yàn)，迫切需要一種高敏的生物標(biāo)記物對(duì)靶點(diǎn)作用進(jìn)行分析。本文研究者利用Simoa技術(shù)開發(fā)了一種靈敏可靠的poly（GP）二肽重復(fù)蛋白測(cè)定方法。

文章題目：Development of a sensitive trial-ready poly(GP) CSF biomarker assay for C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis

發(fā)表時(shí)間：2022年4月

期刊名稱：J Neurol Neurosurg Psychiatry

影響因子：13.654

DOI：10.1136/jnnp-2021-328710

研究概述

研究人員通過Simoa平臺(tái)開發(fā)了一種免疫分析方法，用于測(cè)量C9orf72相關(guān)FTD和ALS患者腦脊液（CSF）中C9orf72重復(fù)擴(kuò)增產(chǎn)生的poly(GP) 二肽重復(fù)蛋白（DPR）。

研究表明，該分析方法高度靈敏和穩(wěn)定，通過了廣泛的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，板內(nèi)、板間的變異性低、標(biāo)曲和樣品的精密度和準(zhǔn)確度高、稀釋線性好、對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)凍融具有耐受性，以及不受血紅蛋白干擾。使用這種方法來測(cè)量FTD突變攜帶者隊(duì)列收集的CSF樣本中的poly(GP) （N=40 C9orf72和15個(gè)對(duì)照）。CSF中C9orf72的poly(GP) 信號(hào)，樣本組的平均信號(hào)值比對(duì)照組高38倍，最低的樣本比對(duì)照組高8倍，均低于該方法的定量下限。而且檢測(cè)的特異性和敏感性均為100%，靶標(biāo)檢測(cè)的窗口較大。

這些數(shù)據(jù)表明，基于Simoa的poly（GP）DPR分析適合用于臨床試驗(yàn)，以明確旨在減少C9orf72重復(fù)的治療藥物的靶向治療。

研究內(nèi)容

1、Simoa poly(GP) assay建立

首先使用Simoa HD-1對(duì)assay進(jìn)行優(yōu)化。研究人員測(cè)試了一系列抗體，包括小鼠抗GP單克隆抗體（mGP），和一系列針對(duì)不同長度GP肽的兔多克隆抗體（GP57、GP60和GP6834）。綜合考慮后選擇了小鼠抗GP單克隆抗體（mGP）作為捕獲抗體，多克隆抗體組合（GP57−60）作為檢測(cè)抗體，標(biāo)準(zhǔn)品為GST-GP32肽段。這套組合的信噪比最高，為2.51；且LLOQ最低，為1.04pg/ml（圖1）。為了確保長期的兼容性，接下來將分析轉(zhuǎn)移到新的Simoa HD-X平臺(tái)。且對(duì)該assay進(jìn)行了重新優(yōu)化，將標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液從裂解液稀釋液B（HD-1）更改為稀釋液A（HD-X）效果最好（圖2A）。此外，SBG從100μM降至50μM，LLOQ為1.17 pg/mL（圖2B）。

Fig.1 Simoa homebrew assay中各抗體組合的比較。虛線分別表示每種測(cè)定方法優(yōu)化后預(yù)測(cè)的LLOQ。AEB：平均每顆磁珠上的酶標(biāo)數(shù)；LLOQ：定量下限；Simoa：單分子陣列；*：代表此種抗體已標(biāo)記上生物素。


Fig.2 將poly(GP) assay轉(zhuǎn)移到Simoa HD-X平臺(tái)。（A）在人腦脊液加入25 pg/mL GST-GP32標(biāo)準(zhǔn)品，然后用不同的Quanterix稀釋液1:2進(jìn)行稀釋，通過比較信號(hào)/噪聲(S/N)來評(píng)估樣品稀釋液的效果。（B）使用Quanterix分析顯像工具計(jì)算擬合的標(biāo)準(zhǔn)品曲線，虛線顯示LLOQ為1.17 pg/mL。

2. Simoa poly(GP) assay驗(yàn)證為將該assay用于臨床試驗(yàn)，使用標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)記物分析鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估（表2）。由圖3可知，各項(xiàng)結(jié)果表明，該測(cè)定具有高度的靈敏度和穩(wěn)健性，通過了標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)記物分析鑒定標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)估，包括板內(nèi)和板間的低變異性、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的高精密度和準(zhǔn)確度、稀釋線性、樣品和標(biāo)準(zhǔn)凍融耐受性以及血紅蛋白干擾測(cè)試。

Fig.3 CSF poly(GP) Simoa assay驗(yàn)證結(jié)果。制備了10點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線和3個(gè)質(zhì)量控制(QC)樣品，分別進(jìn)行了7次獨(dú)立檢測(cè)。(A) 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的變異系數(shù)(CV)均小于20%。(B)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的總差(DFT)。DFT=標(biāo)準(zhǔn)品的預(yù)測(cè)濃度與實(shí)際濃度之差的%。(C)QC樣品的CVs。(D)由兩個(gè)工作人員分別制備的QC樣本的AEB信號(hào)值。(E) QC樣品

3.使用優(yōu)化的Simoa測(cè)定法測(cè)量C9orf72 擴(kuò)增載體CSF中的poly(GP)

使用這種優(yōu)化后的測(cè)定方法來測(cè)量健康對(duì)照組（N=15）和C9orf72擴(kuò)增陽性組（N=40）的腦脊液隊(duì)列中的poly(GP)。來自最低C9orf72樣本的分析信號(hào)的信噪比是對(duì)照樣本平均信號(hào)的八倍，顯示出與對(duì)照CSF信號(hào)的明顯分離（圖4A）。C9orf72組與對(duì)照組的信噪比平均為38倍。健康人腦脊液中的poly(GP)在15個(gè)樣本中有13個(gè)低于檢測(cè)限，其余2個(gè)低于LLOQ。

在所有C9orf72組中檢測(cè)到poly(GP)高于LLOQ，在沒有健康對(duì)照的情況下，敏感性和特異性均為100%。在C9orf72擴(kuò)增陽性樣本中，poly(GP) 的測(cè)量范圍為6-148 pg/mL。發(fā)現(xiàn)男性和女性C9orf72擴(kuò)增陽性樣本之間的poly(GP) 水平?jīng)]有差異。發(fā)現(xiàn)CSF poly(GP)水平與癥狀性C9orf72擴(kuò)增陽性樣本（n=15）的發(fā)病年齡之間沒有相關(guān)性（圖4C）。有趣的是，對(duì)所有40例C9orf72擴(kuò)增陽性病例進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，樣本采集時(shí)的年齡與腦脊液中測(cè)得的poly（GP）之間存在顯著的中度正相關(guān)（r=0.3643）。然而，如果從分析中刪除具有最高poly(GP)水平的情況，則p值變?yōu)閜=0.0522。

Fig.4 C9orf72擴(kuò)增攜帶者腦脊液中Poly(GP) 水平

總結(jié)

1. 準(zhǔn)確測(cè)量FTD和ALS引起C9orf72 重復(fù)擴(kuò)增產(chǎn)生的DPR，將是評(píng)估臨床試驗(yàn)中重復(fù)/DPR降低策略目標(biāo)參與度的關(guān)鍵工具。
2. 現(xiàn)有免疫測(cè)定法，可以檢測(cè)患者CSF中的poly(GP) DPR，但由于一些患者的poly(GP) 水平接近背景，可能需要提高靈敏度。
3. 該研究報(bào)告了一種適合臨床試驗(yàn)的超靈敏腦脊液聚糖蛋白檢測(cè)方法的開發(fā)。能在絕大多數(shù)試驗(yàn)參與者中評(píng)估目標(biāo)參與度，包括低聚糖蛋白水平的參與者。

參考文獻(xiàn)：Wilson KM, Katona E, Glaria I, Carcolé M, Swift IJ, Sogorb-Esteve A, Heller C, Bouzigues A, Heslegrave AJ, Keshavan A, Knowles K, Patil S, Mohapatra S, Liu Y, Goyal J, Sanchez-Valle R, Laforce RJ, Synofzik M, Rowe JB, Finger E, Vandenberghe R, Butler CR, Gerhard A, Van Swieten JC, Seelaar H, Borroni B, Galimberti D, de Mendonça A, Masellis M, Tartaglia MC, Otto M, Graff C,Ducharme S, Schott JM, Malaspina A, Zetterberg H, Boyanapalli R, Rohrer JD, Isaacs AM; Genetic FTD Initiative (GENFI). Development of a sensitive trial-ready poly(GP) CSF biomarker assay forC9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2022 Apr 4:jnnp-2021-328710. doi: 10.1136/jnnp-2021-328710. Epub ahead of print. PMID: 35379698.