一、細胞簡介：

　　細胞名稱：L-929（NCTCclone929）小鼠成纖維細胞

　　平臺編號:zl-056197

　　1948年三月建立了NCTCclone929(小鼠結締組織)，細胞系L的克隆。細胞系L是最早建立的連續(xù)培養(yǎng)細胞系之一，而clone929是最早的克隆株。從一只100日齡的雄性C3H/An小鼠的正常皮下疏松結締組織入脂肪組織中建立了親本細胞系L。第95代的細胞系L使用毛細管法分離單細胞建立了clone929。檢測發(fā)現(xiàn)鼠痘病毒陰性。

　　細胞特性

　　1）來源：組織：皮下結締組織；疏松結締組織及脂肪品系：C3H/An

　　2）形態(tài)：成纖維細胞，貼壁生長

　　3）含量：>1x106細胞數(shù)

　　4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

　　5)用途：僅供科研使用。

　　二．細胞的培養(yǎng)：

　　1）準備MEM培養(yǎng)基；馬血清10%；雙抗，1%。該細胞不能用胎牛血清培養(yǎng)。

　　2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%馬血清或完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　三．細胞處理：

　　1）凍存細胞的復蘇：

　　將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

　　2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

　　對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

　　1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

　　2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

　　3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行。

　　3）細胞凍存:收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。

　　四、運輸和保存

　　干冰運輸及復蘇好存活細胞

　�。�1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

　�。�2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發(fā)貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

　　五、細胞接收后的處理

　　1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系質粒載體網(wǎng)。

　　2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態(tài)，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態(tài)的依據(jù)。

　　3）貼壁細胞：細胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

　　4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后第一次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。

　　六、應用

　　用于羊棲菜多酚分離純化及對小鼠成纖維細胞抗紫外損傷影響研究

　　運用Folin-Ciocalteu比色法對羊棲菜多酚含量進行測定,并對該方法進行了優(yōu)化;然后利用酶輔助提取法對羊棲菜多酚進行提取,并對提取條件進行了優(yōu)化;采用大孔吸附樹脂法對羊棲菜多酚進行分離純化,并對純化條件進行了優(yōu)化以獲得高純度的羊棲菜多酚,另外測定了其體外抗氧化能力。

　　通過羊棲菜多酚對UV照射的小鼠成纖維細胞的保護作用、修復作用及細胞內有關抗氧化酶的變化,研究了羊棲菜多酚對小鼠成纖維細胞抗紫外損傷的影響,為羊棲菜多酚在抗紫外損傷方面的應用提供了一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

　　為了明確羊棲菜多酚對UV照射的小鼠成纖維細胞抗紫外損傷的影響,研究了UV輻射劑量、羊棲菜多酚濃度及時間對細胞生長的影響,結果表明UV輻射劑量越大,小鼠成纖維細胞受到抑制越嚴重,UV輻射劑量為0.15J/cm2時最接近半致死劑量,作為后續(xù)實驗的UV照射劑量;羊棲菜多酚對小鼠成纖維細胞的保護作用隨多酚濃度的增大呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢,在羊棲菜多酚濃度為90μg/mL時保護作用最強。

　　從時間上看,加入羊棲菜多酚后培養(yǎng)4h再進行UV照射,保護作用最明顯,隨著時間的延長,保護作用開始下降。羊棲菜多酚對UV照射的小鼠成纖維細胞的修復作用,同樣隨著羊棲菜多酚濃度的增大呈先增強后減弱的趨勢,在80μg/mL濃度時修復作用達到最強。此外,羊棲菜多酚能增強UV照射的小鼠成纖維細胞內超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,并降低丙二醛的含量。