背景介紹 

藥物性肝損傷（DILI）會(huì)影響肝臟代謝和解毒能力，但其根本機(jī)制仍有很多未知。為了準(zhǔn)確和可再現(xiàn)地預(yù)測(cè)人的DILI，非常需要體外肝臟模型來替代昂貴和低通量的2D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、動(dòng)物研究和芯片實(shí)驗(yàn)室模型。我們提出了一種新的“droplet in droplet”（DID）生物打印方法，該方法可以產(chǎn)生用于肝毒性研究的生理相關(guān)肝臟模型。這些模型，或稱微型肝臟，是用BIO X微滴打印包裹在ⅰ型膠原中的肝(HepG2和LX2 肝星狀細(xì)胞)和非肝(HUVEC 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞制成的。培養(yǎng)7天后，將微型肝臟暴露于急性和高劑量的對(duì)乙酰氨基酚或氟他胺，然后評(píng)估細(xì)胞活力、白蛋白分泌、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性和脂質(zhì)積累的變化。微型肝臟ALT活性增加，白蛋白和脂質(zhì)生成減少，表面這兩種藥物均有細(xì)胞毒性反應(yīng)。這項(xiàng)研究的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了3D生物打印是一種可行的、可用于模擬肝組織和篩選特異性藥物反應(yīng)的中到高通量的解決方案。
 

 材料和方法 

細(xì)胞準(zhǔn)備

根據(jù)建議的方案培養(yǎng)兩種肝細(xì)胞（HepG2和LX2）和一種非肝細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞系，并每3-4天傳代一次。HepG2在含有谷氨酰胺的MEMα中生長，并補(bǔ)充1%丙酮酸鈉(Gibco，Cat#11360070)和1%MEM非必需氨基酸溶液(Gibco，Cat-#11140050)。LX2細(xì)胞在IMDM(Gibco，Cat#12440053)中生長，HUVEC在EGM-2生長培養(yǎng)基(Lonza，Cat#CC-3156)中培養(yǎng)，并添加單體補(bǔ)充劑(Lonza，Cat#CC-4176)。所有培養(yǎng)基均添加10%的FBS(Gibco，16000044類)和1%的青霉素鏈霉素(Gibco，參考文獻(xiàn)1509-70-063)。
 

生物墨水的制備和DID生物打印

中和并制備3mg/mL濃度的Coll I bioink(CELLINK，SKU#IK4000002001)用于生物打印。以1:1:2（LX2:HUVEC:HepG2）的比例將5x106個(gè)細(xì)胞/毫升裝入冷凍墨盒。在未經(jīng)處理的96孔板(Thermo Fisher Scientific)中，使用BIO X(CELLINK，SKU#0000000 2222)上的液滴打印功能對(duì)微型肝臟進(jìn)行生物打印。使用設(shè)置為8°C的溫控打印頭(TCPH，SKU#0000000 20346)將膠原液滴分配到設(shè)置為8°C–10°C的冷卻打印床上。在第一輪液滴打印后，樣品在37°C下培養(yǎng)3分鐘，然后返回BIO X，使用相同參數(shù)進(jìn)行第二輪液滴打印。在37°C條件下，將得到的封裝液滴熱交聯(lián)20分鐘，并為每個(gè)孔提供200微升混合培養(yǎng)基（25%IMDM+25%DMEM+50%MEM）。培養(yǎng)液每2-3天更新一次。
 

 

藥物處理和分析

培養(yǎng)7天后，用不同濃度的APAP[0.1,0.5,1,5,10,25,50 mM]（Abcam）或FLU[10,25,50,75,100,150,200µM]（Selleckchem）處理微型肝臟72小時(shí)。采用比色溴甲酚綠（BCG）測(cè)定法（Sigma-Aldrich）、ALT活性測(cè)定法（BioVision）和活/死染色試劑盒（Invitrogen）分別檢測(cè)白蛋白產(chǎn)生、肝損傷和細(xì)胞活力。所有分析均按照制造商的說明進(jìn)行。
 

 結(jié)論 

膠原I中的細(xì)胞生長和球體形成

膠原I中的細(xì)胞生長和球體形成在這項(xiàng)研究中，我們?cè)u(píng)估了Coll I bioink中的細(xì)胞生長、球體形成和遷移模式。到第2天，HepG2和LX2已緊密組裝成小簇，HUVEC已拉長，形成同心網(wǎng)絡(luò)（圖1）。使用膠原蛋白作為支架可以在整個(gè)培養(yǎng)過程中進(jìn)行細(xì)胞重組、球體極化和細(xì)胞增殖（數(shù)據(jù)未顯示）。此外，根據(jù)圖1，很明顯，細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)過程中滲透DILI模型，并可能在內(nèi)部和外部液滴層之間遷移。
 

生物打印微型肝臟的藥物治療和細(xì)胞毒性

第10天的毒性評(píng)估結(jié)果表明，生物打印微型肝臟對(duì)APAP（圖2A）和FLU（圖2B）具有細(xì)胞毒性和劑量依賴性反應(yīng)。這種肝功能下降表現(xiàn)為白蛋白分泌和脂質(zhì)生成減少，ALT活性上調(diào)。同樣明顯的是，基于ALT活性的增加，兩種藥物的毒性劑量都會(huì)對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生破壞性影響。后者在圖3中尤為明顯，其中活/死圖像表明，在較高濃度的APAP或流感病毒下，細(xì)胞活力顯著降低。
 

藥物治療的動(dòng)態(tài)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)

研究了APAP和FLU如何調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪含量。肝組織的ORO染色通常用于識(shí)別脂肪酸或藥物引起的不同階段纖維化或脂肪變性（Pingitore，2019）。在我們的研究中，經(jīng)處理的微型肝臟的ORO染色顯示，在高劑量藥物處理的樣本中，脂肪積累最小，而在未經(jīng)處理或低劑量藥物治療的樣本中，脂肪積累顯著（圖4A）。一種解釋是APAP和FLU與脂質(zhì)過氧化有關(guān)，其中毒性藥物水平引起的氧化應(yīng)激可能引發(fā)脂質(zhì)降解和膜損傷（Behrends，2019）。圖4B中未處理樣品的詳細(xì)觀察提供了液滴模型中液滴的橫截面圖。這張圖片顯示了大量細(xì)胞向液滴外殼遷移并產(chǎn)生脂肪，可能表明存在營養(yǎng)和氧氣梯度，并驗(yàn)證了細(xì)胞重組模式和膠原內(nèi)的球體極化。
 

▶  作為2D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、動(dòng)物研究和芯片實(shí)驗(yàn)室原型的可靠替代品，BIO X可作為中高通量工具，用于制作功能性3D生物打印肝臟模型，實(shí)現(xiàn)藥物篩選和分析，并減輕藥物消耗的成本。

▶  CELLINK Coll I作為DID模型的支架，為模型提供了一個(gè)穩(wěn)定、可調(diào)和高度相容的環(huán)境，且具有豐富的肝細(xì)胞重排和球體形成的結(jié)合位點(diǎn)。

▶  基于脂質(zhì)過氧化、白蛋白分泌減少和ALT活性上調(diào)的證據(jù)，我們的研究結(jié)果表明，DID微型肝臟具有功能性，并且對(duì)APAP和FLU具有劑量依賴性和細(xì)胞毒性反應(yīng)。

▶  DID模型允許組織層之間的細(xì)胞間相互作用，并為研究不同硬度層之間的遷移模式提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)。未來的毒性研究可以采用該模型復(fù)制纖維化的各個(gè)階段，或研究藥物治療后肝臟組織的再生能力。

參考文獻(xiàn)：

1.Behrends, V., Giskeødegård, G. F., Bravo-Santano, N., Letek, M., & Keun, H. C. Acetaminophen cytotoxicity in HepG2 cells isassociated with a decoupling of glycolysis from the TCA cycle, loss of NADPH production, and suppression of anabolism. Archivesof Toxicology. 2019; 93(2): 341–353. DOI: 10.1007/s00204-018-2371-0.

2.Chen, M., Suzuki, A., Borlak, J., Andrade, R. J., & Lucena, M. I. Drug-induced liver injury: Interactions between drug properties andhost factors. Journal of Hepatology. 2015; 63: 503–514. DOI: 10.1016/j.jhep.2015.04.016.

3.Pingitore, P., Sasidharan, K., Ekstrand, M., Prill, S., Lindén, D., & Romeo, S. Human multilineage 3D spheroids as a model of liversteatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 2019; 20(7): 1629.