導(dǎo)讀

在癌癥生物學(xué)中，腫瘤微環(huán)境(TME)是腫瘤細胞和免疫系統(tǒng)之間的一個關(guān)鍵。TME是細胞外基質(zhì)(ECM)、免疫細胞、信號分子、血管和成纖維細胞，它們包裹腫瘤并影響癌癥進展。TME的成分通過分泌小信號分子相互作用，影響腫瘤行為的各個方面，包括細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤治療的耐藥性(Bremnes,2011)。因此，重建TME對抗癌研究至關(guān)重要，但一個主要的痛點是無法開發(fā)出可預(yù)測的3D腫瘤模型用于高通量藥物評估。3D腫瘤模型應(yīng)再現(xiàn)腫瘤間質(zhì)內(nèi)細胞間的相互作用，并克服2D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的局限性。在這里，3D生物打印為預(yù)測體內(nèi)結(jié)果、建模TME和評估藥物反應(yīng)提供了一個有前景的解決方案。

腫瘤轉(zhuǎn)移和化療耐藥性威脅著腫瘤患者的生存。在癌癥治療領(lǐng)域，化療是一種很有效的治療方式，它利用小的抗癌分子攻擊特定的生長途徑并殺死癌細胞。在這些分子中，順鉑(CIS）和吉非替尼(GEF)是FDA批準(zhǔn)的靶向DNA和EGFR通路的抗癌藥物。簡而言之，CIS通過抑制細胞分裂和 mRNA的產(chǎn)生導(dǎo)致細胞凋亡，而GEF干擾癌細胞中EGFR信號的上調(diào)。有趣的是，雖然CIS和GEF都被用于治療致命的胰腺癌和乳腺癌，但它們也與體外假陰性或假陽性預(yù)測有關(guān)，這表明它們在2D和3D中對細胞的影響不同(Reynolds, 2017)。為了進一步解決這一差異，我們使用兩種乳腺癌(MCF7, MDA MB 231)和兩種胰腺癌(BxPC3, Panc-1)細胞系，比較了CIS和GEF對2D單層細胞和3D生物打印類腫瘤模型的作用。

材料和方法

生物墨水制備和生物打印

根據(jù)CELLINK方案制備3 mg/mL Coll 1 (CELLINK, Ref #IK4000002001)和5% GelMA (CELLINK, Ref #IK3051020303)用于生物打印。共3ml Coll 1或GelMA與5 x 106 cells/100µL培養(yǎng)基(10:1)混合，分別裝入透明和琥珀色墨盒(CELLINK, Ref #CSO010311502)，以~ 3kpa進行液滴打印。使用溫度控制的打印頭(TCPH, SKU #000000020346)設(shè)置為8℃，氣動打印頭分別在8℃的打印床上對Coll 1和GelMA液滴進行生物打印。使用BIO X (CELLINK, SKU #000000022222)上的液滴打印功能，將每種生物墨水打印在未經(jīng)處理的96孔板(Thermo Fisher Scientific, Cat #267427)上。打印完成后，Coll 1液滴在37℃下熱交聯(lián)20分鐘，GelMA液滴在365 nm下紫外交聯(lián)6秒。每孔加100µL培養(yǎng)基，每2 ~ 3天更換一次。

2D單層培養(yǎng)

為了進行2D比較，將每個細胞株接種在處理過的96孔板上(Thermo Fisher Scientific, Cat #167425)。優(yōu)化各細胞培養(yǎng)48小時后的細胞密度，達到90%的一致性。Panc-1細胞接種1.2 × 104個細胞/孔，BxPC3細胞接種1.7 × 104個細胞/孔，MCF7細胞接種2.0 × 104個細胞/孔，MDA MB 231細胞接種2.0 × 104個細胞/孔。

藥物治療與分析

生物打印類腫瘤細胞和2D細胞分別用不同濃度的吉非替尼(LC Laboratories，#G-4408)或順鉑(Cayman Chemical Company)處理96小時和48小時。MTS Assay(Sigma-Aldrich)和LIVE/DEAD染色試劑盒(Invitrogen)用于評估2D和3D條件下的細胞活力。所有的檢測都是按照制造商的說明進行的。

圖1：該測定的優(yōu)點顯示了抗腫瘤藥物對所有4種細胞系的強大作用，并描述了每種細胞類型和ECM的細胞形態(tài)變化。比例尺：1000m或650m。綠色：LIVE，紅色:DEAD

腫瘤根據(jù)細胞類型和培養(yǎng)條件適應(yīng)不同的形態(tài)(Nath, 2016)。在GelMA和Coll 1中培養(yǎng)7天后，癌細胞聚集形成各種形態(tài)的球體。如圖1所示，MDA MB 231細胞形成同心星形網(wǎng)絡(luò)，MCF7細胞形成圓形橢球，BxPC3細胞形成葡萄狀橢球，Panc-1細胞形成團塊狀橢球。使用GelMA和Coll 1作為腫瘤支架，由于孔隙度、剛度和成分的不同，也影響了球狀體的形成。有趣的是，2D培養(yǎng)的癌細胞缺乏所描述的形態(tài)，可能是因為它們?nèi)狈χС旨毎�間相互作用、緊密連接、營養(yǎng)和氧梯度的ECM(數(shù)據(jù)未顯示)。

3D模型的缺氧效應(yīng)

缺氧是藥物反應(yīng)的另一個變量，這是3D模型和體內(nèi)組織所特有的。Warburg效應(yīng)將缺氧描述為癌細胞的一種生存模式，它們從生產(chǎn)氧氣和ATP轉(zhuǎn)換為上調(diào)EGFR和AKT信號以促進增殖。這種轉(zhuǎn)換增加了毒性、酸度和3D模型中的廢物堆積，從而產(chǎn)生了一個三環(huán)低氧梯度。圖1顯示了低氧梯度，其中靠近球體中心的細胞呈死亡狀態(tài)(紅色)，邊緣的細胞呈存活狀態(tài)(綠色)。最外面的環(huán)是一層增殖細胞，中間的環(huán)是一層活細胞，最里面的環(huán)是壞死細胞的核心，這是由于廢物堆積和缺氧造成的(Nath, 2016)。

順鉑在2D和3D模型的療效

分別在第2天和第7天，將低到高劑量的CIS添加到2D單層細胞和3D生物打印類腫瘤細胞中。2D細胞處理治療48小時，3D生物打印類腫瘤治療96小時。MTS試驗顯示，2D單層對所有細胞株的細胞毒性均呈劑量依賴性，3D乳腺癌類腫瘤細胞也是如此(圖2A)。有趣的是，BxPC3和Panc-1細胞株在3D中比在2D中顯示更高的IC50。換句話說，這兩種胰腺癌細胞株在3D生物打印類腫瘤中基本上不受CIS的影響。這里，一種解釋是胰腺癌細胞對CIS濃度的增加表現(xiàn)出了耐藥性(Wang, 2016;凱蘭,2007;Sangster-Guity, 2011)。針對藥物治療，胰腺癌細胞可能已經(jīng)誘導(dǎo)了他們的生存途徑，上調(diào)衰老、DNA損傷反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和跨損傷DNA合成(Gomes, 2019年)。

吉非替尼在2D和3D模型的療效

EGFR癌蛋白常在乳腺癌和胰腺癌細胞系中表達。因此，藥物抑制EGFR通路可導(dǎo)致細胞周期阻滯、衰老或凋亡(Jacobi, 2017)。如圖2B所示，在3D和2D中，吉非替尼顯著降低了細胞活力。對于所有細胞類型，3D Coll 1和GelMA的IC50均低于2D培養(yǎng)的IC50，這表明GEF在3D生物打印類腫瘤細胞中比在2D培養(yǎng)中造成更多的死亡。

2D細胞培養(yǎng)的局限性

2D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)不能模擬體內(nèi)腫瘤的內(nèi)在特性，包括自然屏障、低氧梯度和緊密的細胞-細胞連接，這些都減緩了藥物擴散。此外，它們?nèi)狈χС?D生長和癌蛋白上調(diào)的組織特異性環(huán)境和ECM (Reynolds, 2017)。圖2A的另一項研究顯示，3D胰腺癌細胞比2D單層細胞對CIS的抗性更強。很明顯，2D研究對于胰腺癌的體內(nèi)治療是一種誤導(dǎo)和不準(zhǔn)確的預(yù)測。

結(jié)論

使用CELLINK GelMA和Coll 1作為類腫瘤支架，為球狀形成和藥物擴散提供了穩(wěn)定的腫瘤微環(huán)境（TME）。

用GelMA和Coll 1構(gòu)建的不同殺傷曲線模型表明，細胞外基質(zhì)（ECM）在藥物反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。未來的研究需要確定哪種支架適合特定的腫瘤模型。

我們的研究結(jié)果顯示，在2D和3D腫瘤模型中，順鉑(CIS)和吉非替尼(GEF)治療具有劑量依賴性和細胞特異性反應(yīng)。乳腺癌和胰腺癌細胞株在3D條件下比2D條件下對GEF更敏感。同樣，乳腺癌細胞株3D對CIS治療的敏感性高于2D，而胰腺細胞株對CIS治療的敏感性則相反，提示3D模型的耐藥水平升高。

3D生物打印類腫瘤模型用于藥物篩選，可用于減少假陰性和假陽性預(yù)測。未來的研究可以使用BIO X來擴大類腫瘤的生產(chǎn)，用于高通量藥物測試。