PCR簡(jiǎn)介

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA為模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴(kuò)增至足夠數(shù)量，以便進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析的一種反應(yīng)。
 

PCR擴(kuò)增原理

核酸降解是DNA/RNA分子中的堿基和戊糖間的氮糖苷鍵，或磷酸二酯鍵在物理因素、化學(xué)因素和生物因素等作用下發(fā)生水解，使DNA/RNA鏈發(fā)生斷裂。

▲ 圖一：PCR原理反應(yīng)示意圖

▲ 圖二：PCR反應(yīng)過(guò)程中溫度變化圖

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)軟件可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，計(jì)算待測(cè)樣本的初始模板濃度。

▶  初始DNA濃度越高，熒光達(dá)到某一值（閾值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少（Cq值）。

▶  Log濃度與循環(huán)數(shù)成線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增到閾值的循環(huán)數(shù)與已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比就可以計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

影響PCR擴(kuò)增的因素

▶  模板間的交叉污染。

▶  PCR試劑的污染。

▶  PCR產(chǎn)物的污染。

防止污染的預(yù)防操作

❶ 永遠(yuǎn)要設(shè)置NTC（No Template Control）對(duì)照，一個(gè)不含有模板DNA但含有PCR體系中所有其他成分的對(duì)照。如果不能在污染的第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)一系列的數(shù)據(jù)無(wú)法使用。

❷ 準(zhǔn)備PCR體系的移液器要專(zhuān)用，千萬(wàn)不能用吸取過(guò)PCR產(chǎn)物的移液器去準(zhǔn)備PCR體系。

❸ 打開(kāi)離心管前先離心，開(kāi)管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

❹ 最好在加完其他反應(yīng)成分再加入模板。

❺ 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)清理臺(tái)面。

出現(xiàn)污染后的解決辦法

❶ 更換試劑：更換新的試劑和水，用確保無(wú)污染的移液器分裝備用。

❷ 清潔所有可能的污染源：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，離心機(jī)，門(mén)把手等。

❸ 實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加小心，采用前面提到的各種防止污染的方法。

Cielo^TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

Harness of the power of qPCR

☑  數(shù)據(jù)可靠性：連續(xù)1000次實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果高度一致。

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