近日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院滕堯樹副主任醫(yī)師及其團(tuán)隊(duì)在SCI收錄期刊frontiers in Genetics (IF：4.599) 上發(fā)表了題為Comprehensive Analysis of Sinonasal Inverted Papilloma Expression Profiles Identifies Long Non-Coding RNA AKTIP as a Potential Biomarker的研究論文，揭示了鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤的潛在治療靶點(diǎn)。文章中l(wèi)ncRNA芯片相關(guān)工作由上海生物芯片有限公司（生物芯片上海國家工程研究中心）協(xié)助完成。
 
內(nèi)翻性乳頭狀瘤是鼻腔鼻竇常見的良性腫瘤之一。該病屬于乳頭狀瘤的一種，約占鼻內(nèi)乳頭狀瘤的70%，約占全部鼻內(nèi)腫瘤的0.5%～4%。雖是一種良性腫瘤，但其特有的術(shù)后復(fù)發(fā)及惡變傾向使得該病擁有區(qū)別于其他鼻內(nèi)良性腫瘤的鮮明特征。

 

原文鏈接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2022.831759/full
 
研究內(nèi)容

長鏈非編碼RNA（lncRNAs）被認(rèn)為是一類新的潛在生物標(biāo)記物和腫瘤治療靶點(diǎn)。本研究旨在探討lncRNAs在鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤（sinonasal inverted papilloma, SNIP）中的表達(dá)譜、潛在功能、診斷和臨床意義。使用基因芯片分析lncRNAs和mRNAs表達(dá)譜，并通過生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)一步分析了特異性lncRNAs的潛在功能和臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，SNIP中有1668個(gè)lncRNAs顯著上調(diào)，1767個(gè)顯著下調(diào)。一些與lncRNAs共表達(dá)的mRNAs在一些生物進(jìn)程和與腫瘤發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞信號通路中富集。lnc-AKTIP可能與多種腫瘤相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，如PCBP2、IRF-1和p53。lnc-AKTIP的ROC曲線分析顯示曲線下面積為0.939。值得注意的是，與正常組織相比，lnc-AKTIP在SNIP組織中的表達(dá)水平顯著降低，并且與SNIP分期相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，lnc-AKTIP可作為SNIP的一種有價(jià)值的診斷生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。

1.SNIP組織中l(wèi)ncRNAs和mRNAs表達(dá)譜概述
 
主成分分析 (PCA) 顯示SNIP組織和非腫瘤組織之間存在巨大差異（圖1A）。為了確定SNIP中可能涉及的差異表達(dá)lncRNAs和mRNAs，首先使用人lncRNA芯片（4×180K）分析SNIP中l(wèi)ncRNAs和mRNAs的表達(dá)譜。與對照組的4個(gè)相應(yīng)的非腫瘤組織樣本相比，4個(gè)SNIP組織樣本中共有3435個(gè)lncRNAs和4696個(gè)mRNAs的表達(dá)存在顯著差異（圖1）。lnc-SPRR1B-1:1和lnc-PRH1-1:13分別是最上調(diào)和下調(diào)的lncRNAs；A2ML1和DMBT1分別是最上調(diào)和下調(diào)的mRNAs。結(jié)果表明，這4種異常表達(dá)的RNAs可能在SNIP的發(fā)展和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

圖1 SNIP組織和非腫瘤組織中l(wèi)ncRNAs和mRNAs表達(dá)譜的改變

 
2.qRT-PCR對候選lncRNAs和mRNAs的驗(yàn)證
 
為了驗(yàn)證芯片分析所得數(shù)據(jù)，進(jìn)行qRT-PCR以確認(rèn)隨機(jī)選擇的8個(gè)lncRNAs和3個(gè)mRNAs表達(dá)水平。在SNIP組和對照組的兩個(gè)擴(kuò)展panel中進(jìn)行qRT-PCR。6種lncRNAs和2種mRNA的qRT-PCR結(jié)果與芯片分析結(jié)果一致，而lnc-AZIN1-1:5、NR_024061和RARRES2的結(jié)果不一致，一致率為72.7%（8/11）（圖2）。

圖2 對差異表達(dá)的8個(gè)lncRNAs和3個(gè)mRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證

3.lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

為探索SNIP組織中l(wèi)ncRNAs和mRNAs之間的潛在相互作用，通過計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)和FDR值，從芯片數(shù)據(jù)中分析了前400個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs之間的相關(guān)性，并使用Cytoscape軟件構(gòu)建并可視化lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)包含305個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括155個(gè)lncRNAs和150個(gè)mRNAs，其中670個(gè)顯著相關(guān)對為正，99個(gè)顯著相關(guān)對為負(fù)。該網(wǎng)絡(luò)還表明，單個(gè)lncRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)編碼基因的RNA表達(dá)，一些lncRNAs可以協(xié)同調(diào)節(jié)同一基因的表達(dá)（圖3）。

圖3 lncRNA-mRNA關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測

4.lncRNAs共表達(dá)mRNAs的富集分析

為了研究差異表達(dá)的lncRNAs在SNIP進(jìn)展中的潛在作用，分析了lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中候選RNAs的功能富集。GO富集分析顯示，在生物進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞成分類別中包含幾個(gè)明顯過度表達(dá)的富集項(xiàng)。這些mRNAs在多種生物進(jìn)程中富集，如自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性 (GO:0042267) 、蛋白水解的負(fù)調(diào)節(jié) (GO:0045861) 和蛋白質(zhì)加工的負(fù)調(diào)節(jié) (GO:0010955)。通路富集分析表明，這部分差異表達(dá)的mRNAs參與了PPAR信號通路 (ID:hsa03320)、Jak-STAT信號通路 (ID:hsa04630) 和胰島素信號通路 (ID:hsa04910)（圖4）。

圖4 與lncRNAs共表達(dá)的mRNAs的富集分析

5.lnc-AKTIP的生物信息學(xué)分析
 
lnc-AKTIP預(yù)計(jì)存在于染色體16q12.2上，其DNA序列無法編碼蛋白質(zhì)（圖5A）。lnc-AKTIP的最適二級結(jié)構(gòu)有幾個(gè)發(fā)夾環(huán)，最小自由能 (MFE) 為-152.30 kcal/mol（圖 5B）。lnc-AKTIP和幾種蛋白質(zhì)之間存在強(qiáng)烈的相互作用，ELAVL3、ELAVL2和PCBP2蛋白質(zhì)與lnc-AKTIP頻繁結(jié)合（圖5C）。對潛在轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測顯示，lnc-AKTIP與46種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，如IRF-1、p53、GATA-2、Elk-1和HNF-1A（圖5D）。lnc-AKTIP的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)參與了CXCL8、IL20RB、ABCA12和RAET1E等多基因的mRNAs表達(dá)。這些mRNAs富含多種GO項(xiàng)，包括細(xì)胞遷移的負(fù)調(diào)節(jié) (GO:0090051) 、表皮細(xì)胞分化 (GO:0009913) 、上皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié) (GO:0050678) 和自然殺傷細(xì)胞的調(diào)節(jié) (GO:0002228)。它們還被用于進(jìn)一步的通路富集分析，發(fā)現(xiàn)多種與腫瘤相關(guān)的信號途徑，包括化學(xué)致癌、p53信號途徑，以及病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用，都得到了富集（圖5E）。

圖5 lnc-AKTIP的生物信息學(xué)分析

6.lncRNA作為SNIP潛在生物標(biāo)志物的預(yù)測效率
為確認(rèn)lnc-AKTIP、lnc-GNG5P2和lnc-CRLF1是否可以作為SNIP的診斷生物標(biāo)記物，在SNIP組和對照組的兩個(gè)擴(kuò)展panel中進(jìn)行了qRT-PCR，并建立了ROC曲線，以確定它們在SNIP中的診斷作用。ROC曲線分析顯示，lnc-AKTIP在區(qū)分SNIP患者與對照組方面具有較高的準(zhǔn)確性（敏感性=95.1%）（圖6A）。然而，另外兩個(gè)lncRNAs被發(fā)現(xiàn)不是有價(jià)值的生物標(biāo)記物，其敏感性分別為73.2%和78%（圖6B、C）。

圖6 ROC曲線分析用于評估lnc-AKTIP、lnc-GNG5P2和lnc-CRLF1在鑒別SNIP患者中的診斷作用

7.臨床特征與lnc-AKTIP表達(dá)的關(guān)系
為了確定lnc-AKTIP表達(dá)改變的潛在臨床意義，采用卡方檢驗(yàn)分析了41例SNIP患者lnc-AKTIP表達(dá)與臨床特征之間的相關(guān)性。lnc-AKTIP與腫瘤分期顯著相關(guān)。在lnc-AKTIP上調(diào)的SNIP患者中，86.4%被發(fā)現(xiàn)處于SNIP的早期分期（I+II）。然而，沒有發(fā)現(xiàn)lnc-AKTIP表達(dá)與其他臨床特征，如年齡、性別、吸煙狀況和腫瘤復(fù)發(fā)之間存在關(guān)聯(lián)。
研究結(jié)論

研究揭示了lncRNAs的表達(dá)譜及其在SNIP中的潛在生物學(xué)功能。進(jìn)一步證明了lnc-AKTIP與多種腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子之間的潛在相互作用，以及l(fā)nc-AKTIP的下調(diào)與SNIP腫瘤分期之間的顯著相關(guān)性。同時(shí)揭示了SNIP的潛在生物標(biāo)志物lnc-AKTIP。以上這些信息將有助于進(jìn)一步研究SNIP的發(fā)病機(jī)制，并確定治療SNIP患者的新治療靶點(diǎn)。