生物污染控制策略是最新標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)方針如EN17141及歐盟GMP附錄1的修訂版本的關(guān)鍵要求。歐盟和英國(guó)已采用了2020年發(fā)布的EN17141取代ISO14698。EN17141附錄E章節(jié)對(duì)基于培養(yǎng)技術(shù)的微生物監(jiān)測(cè)方法和取樣器驗(yàn)證指南作了詳細(xì)的說(shuō)明。
 

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本篇《根據(jù)EN17141和ISO14698，使用凝膠膜過(guò)濾器進(jìn)行潔凈環(huán)境中的空氣監(jiān)測(cè)》應(yīng)用說(shuō)明重點(diǎn)關(guān)注活性微生物的監(jiān)測(cè)，并證明通過(guò)凝膠膜過(guò)濾技術(shù)進(jìn)行的微生物空氣監(jiān)測(cè)符合EN17141和ISO14698的要求。
 

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簡(jiǎn)介
 

無(wú)菌和生物制藥生產(chǎn)中必須實(shí)施生物污染控制策略。要實(shí)現(xiàn)這些控制，就需要精心設(shè)計(jì)工藝流程以免污染、實(shí)施監(jiān)測(cè)系統(tǒng)以監(jiān)測(cè)污染、以及實(shí)施補(bǔ)救策略以迅速解決污染事件。

空氣污染物可通過(guò)主動(dòng)采樣進(jìn)行測(cè)量，而主動(dòng)采樣需要使用專業(yè)的設(shè)備主動(dòng)抽取規(guī)定體積的空氣。這便于準(zhǔn)確測(cè)量每立方米（m³）的空氣中的微生物菌落形成單位的數(shù)量（CFU）。

采樣器效率可分為物理效率和生物效率。物理效率是采樣器收集的微生物數(shù)量與取樣空氣體積中存在的總數(shù)量的比率。生物效率是從空氣樣本中回收的活性微生物數(shù)量與預(yù)期收集的數(shù)量的比率。
 
物理采樣效率
枯草桿菌黑色變種芽孢（1.2μm x 0.8μm）是一種能夠承受霧化壓力的強(qiáng)健微生物。

在受控環(huán)境室中使用旋轉(zhuǎn)頂部氣溶膠發(fā)生器生成含有不同大小的活枯草芽孢桿菌孢子顆粒的微生物氣溶膠。將含有 0 - 7 %（重量/體積百分比）碘化鉀（Kl）的 80%乙醇的孢子懸浮液（約 106CFU/ml）注入氣溶膠發(fā)生器中。顆粒的大小可通過(guò)旋轉(zhuǎn)頂部的速度和懸浮液中的KI濃度來(lái)調(diào)節(jié)。與氣溶膠發(fā)生器等距放置的采樣器可同時(shí)采集樣本。
 
截留率
通過(guò)使用霧化枯草芽孢桿菌孢子進(jìn)行的細(xì)菌激發(fā)試驗(yàn)（BCT）測(cè)定出了凝膠膜過(guò)濾器的截留率。在BC試驗(yàn)中，使用了 1.2 * 105 CFU/cm² 枯草芽孢桿菌孢子來(lái)挑戰(zhàn)凝膠過(guò)濾器，然后檢測(cè)過(guò)濾后的空氣是否受到枯草芽孢桿菌的污染。凝膠過(guò)濾器對(duì)枯草芽孢桿菌孢子的最高截留率 > 97.996%（圖1）。

圖1：用 1.2 * 105 CFU/cm²的枯草芽孢桿菌孢子進(jìn)行激發(fā)試驗(yàn)后得出的凝膠膜過(guò)濾器截留率。
 

物理采樣效率
結(jié)果表明，0.8μm和 16μm之間顆粒的收集效率沒有顯著的差異（圖2）。

圖2：與Casella狹縫取樣器相比，凝膠膜過(guò)濾器在不同粒徑的 1.2 * 105CFU/cm²枯草芽孢桿菌孢子激發(fā)時(shí)的物理取樣效率。
 

生物采樣效率
試驗(yàn)結(jié)果表明，凝膠膜過(guò)濾器可以可靠地收集空氣中的攜菌顆粒，且不會(huì)降低回收率。

通過(guò)從含有植物細(xì)菌的氣溶膠中取樣，并將其與實(shí)驗(yàn)室自然空氣中的微生物回收率進(jìn)行比較，測(cè)定出了凝膠過(guò)濾法的生物效率。

大腸桿菌和枯草芽孢桿菌
通過(guò)噴灑在環(huán)境室內(nèi)生成含有枯草桿菌黑色變種孢子（1.2μm x 0.8μm）和革蘭氏陰性大腸桿菌（2μm x 1μm）混合物的氣溶膠。結(jié)果表明，與Casella狹縫取樣器相比，大腸桿菌與枯草芽孢桿菌孢子之間的比率沒有顯著差異（圖3）。這也證實(shí)，基于凝膠膜過(guò)濾的空氣采樣不會(huì)對(duì)植物微生物的生存能力產(chǎn)生不利的影響。
 

圖3.與Casella狹縫取樣器相比，凝膠膜過(guò)濾器的懸浮大腸桿菌/枯草芽孢桿菌孢子生物取樣效率。
 

連續(xù)微生物空氣監(jiān)測(cè)（8 h）
實(shí)驗(yàn)證明，在從環(huán)境空氣中連續(xù)采樣 8 小時(shí)后，與對(duì)照組相比，平均CFU計(jì)數(shù)沒有顯著的變化。此外，與僅 30 分鐘的采樣周期相比，微生物范圍沒有顯著的變化（圖4和圖5）。

圖4.與取樣 30 分鐘后直接放置在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的凝膠過(guò)濾器相比（參照），取樣（試驗(yàn)）8 小時(shí)后凝膠膜過(guò)濾器上的微生物回收率。
 

圖5.在凝膠過(guò)濾器上取樣 8 h（A）后與取樣 30 min后直接放置在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的凝膠過(guò)濾器（B）的回收菌種范圍比較。
  
 

凝膠過(guò)濾法的優(yōu)點(diǎn)

• 在特定時(shí)間內(nèi)增加流速或延長(zhǎng)采樣時(shí)間，可進(jìn)行大容量采樣和/或長(zhǎng)期采樣，并在 8 小時(shí)內(nèi)連續(xù)收集空氣，而不會(huì)對(duì)微生物回收產(chǎn)生不利影響。

• 避免將營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基引入隔離器/灌裝線。

• 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基不會(huì)因脫水而造成水分流失。

• 由于凝膠膜過(guò)濾器容易溶解在瓊脂表面，因此，可確保從孔結(jié)構(gòu)中輕松回收微生物。

• 在典型工作班次 8 小時(shí)的取樣期間，可避免操作員干預(yù)（例如，頻繁更換培養(yǎng)基板）。

• 經(jīng)證實(shí)的病毒截留率有助于監(jiān)測(cè)空氣中傳播的外來(lái)病毒。

• 使用凝膠膜過(guò)濾器和快速檢測(cè)法（PCR）。

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Conclusion
實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與Casella采樣器相比，凝膠膜過(guò)濾器的截留率超過(guò) 97.996%，物理取樣效率超過(guò) 80%。在EN17141和ISO14698標(biāo)準(zhǔn)中，膜過(guò)濾法被指定為高效生物取樣的參考方法。盡管如此，我們還是將凝膠膜過(guò)濾法的生物效率與Casella取樣器的生物效率作了比較，并證明，與Casella取樣器相比，革蘭氏陰性大腸桿菌與枯草芽孢桿菌孢子的比率沒有差異。

即使經(jīng)過(guò) 8 小時(shí)的采樣期，凝膠膜過(guò)濾法的高生物采樣效率仍保持不變。連續(xù)采樣也不會(huì)對(duì)過(guò)濾器的平均CFU計(jì)數(shù)以及回收的微生物種類范圍產(chǎn)生不利的影響。

結(jié)果表明，無(wú)需重新評(píng)價(jià)賽多利斯微生物空氣監(jiān)測(cè)儀器和耗材的功能，并且凝膠膜過(guò)濾方法符合EN17141和ISO14698 的要求。該方法還符合歐盟GMP附錄1，2020年修訂版中關(guān)于活性顆粒環(huán)境監(jiān)測(cè)的規(guī)范。