納米材料“點(diǎn)亮”生命科學(xué)

             —熒光納米探針的生物成像應(yīng)用

 本文作者：Dr. Jessy 

 

從羅伯特虎克自制鏡筒下的小隔間般的植物細(xì)胞，到下村修實(shí)驗(yàn)室中翠色熒熒的水母蛋白，再到莊小威顯示屏上晦明倏爍的染料分子對(duì)，我們從未停下用光學(xué)成像探索生命微觀世界的腳步。而同樣作為二十一世紀(jì)產(chǎn)業(yè)革命的中流砥柱的納米技術(shù)，在材料科學(xué)的賽道上蓬勃發(fā)展至今，終于與生命科學(xué)碰撞產(chǎn)生了新的火花—熒光納米探針，用納米材料的光，點(diǎn)亮生命微觀世界。

 

1、引 言

熒光（fluorescent），是一種光致發(fā)光的自然發(fā)光現(xiàn)象。

自然中的熒光現(xiàn)象不勝枚舉，而從發(fā)光水母中提取的綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein, GFP），是自然給予我們探索微觀生命世界的第一個(gè)火種。將綠色熒光蛋白的基因?qū)�入其他生命體內(nèi)表達(dá)，就可以使原本不具備自然熒光性質(zhì)的生物也能產(chǎn)生綠色熒光。
科學(xué)家通過解析GFP的結(jié)構(gòu)及發(fā)光原理等研究，進(jìn)一步提升了其顏色種類、光強(qiáng)、穩(wěn)定性等性質(zhì)，極大地推動(dòng)了熒光蛋白在生物成像中的應(yīng)用。
雖然熒光蛋白家族日益壯大，但是在應(yīng)用范圍上仍然有所局限，此外，熒光蛋白的發(fā)射光譜較寬且不規(guī)則，多色同步成像時(shí)易發(fā)生串色。通過與化學(xué)合成的碰撞，有機(jī)熒光染料順勢而生，其品類豐富、操作簡單，不但極大地?cái)U(kuò)展了熒光成像的應(yīng)用范圍，還方便進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)，為熒光成像的大發(fā)展奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。

圖1. (a)量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)示意圖及CdSe/ZnS量子點(diǎn)吸收、發(fā)射光譜圖[1]。

 (b)上轉(zhuǎn)換納米探針示意圖[2]及980nm激發(fā)下不同摻雜比例的NaLuF4溶液發(fā)光圖像[3]。

但有機(jī)染料仍然不是熒光成像的最佳拍檔，其熒光效率低、光穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，都是阻礙熒光成像發(fā)展的絆腳石。

在此同時(shí)，納米技術(shù)也在材料領(lǐng)域如火如荼地掀起新一輪技術(shù)革命，納米材料自身特殊的光學(xué)特性、可定向合成組裝等優(yōu)點(diǎn)，均為熒光成像注入了全新的血液。

目前常見熒光納米材料有半導(dǎo)體量子點(diǎn)(Quantum dots, QDs)、上轉(zhuǎn)換稀土材料(Upconversion nanoparticles, UCNPs)、金屬納米粒子等。與其他染料相比，熒光納米材料具有量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、斯托克斯位移大、激發(fā)光譜寬而發(fā)射光譜窄等優(yōu)點(diǎn)，且可以通過尺寸調(diào)節(jié)發(fā)射波長，通過組裝修飾提高其生物相容性、豐富識(shí)別傳感等功能，是未來熒光標(biāo)記的最佳選擇之一。

 

2、熒光納米探針基本工作流程

作為納米化學(xué)與生物成像的交叉結(jié)合位點(diǎn)，熒光納米探針的工程流程與傳統(tǒng)的生物成像的有所不同，是個(gè)涵蓋理論計(jì)算、化學(xué)合成、生物成像，甚至醫(yī)學(xué)檢測等多學(xué)科多領(lǐng)域的長鏈過程。

圖2. 熒光納米探針基本工作流程

首先，熒光納米探針的研究過程大多為應(yīng)用導(dǎo)向的，根據(jù)具體的生物應(yīng)用需求設(shè)計(jì)具有特殊光學(xué)性質(zhì)或其他功能的納米材料（如近紅外、上轉(zhuǎn)換、雙光子等），然后進(jìn)行納米材料的合成與表征，篩選出高質(zhì)量的納米材料。

隨后，再進(jìn)一步考慮探針的生物相容性或光控、載藥、識(shí)別等功能性的需求，對(duì)探針進(jìn)行修飾組裝。最后，在熒光納米探針的生物成像階段，往往會(huì)從體外細(xì)胞到體內(nèi)組織/細(xì)胞，最終應(yīng)用于活體動(dòng)態(tài)成像，或進(jìn)一步服務(wù)于醫(yī)療診斷研究。

光學(xué)顯微鏡在熒光納米探針的研究中的應(yīng)用，大多集中在納米材料的表征篩選和探針的生物成像應(yīng)用兩個(gè)部分。

在材料的表征篩選階段，由于納米材料具有內(nèi)在的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，個(gè)體性質(zhì)往往具有很大的個(gè)體差異性。與傳統(tǒng)的檢測大量粒子整體性質(zhì)的方法相比，光學(xué)顯微鏡可在單粒子水平篩選出高質(zhì)量探針，并進(jìn)一步研究其構(gòu)效關(guān)系，指導(dǎo)納米材料的設(shè)計(jì)以改善其性能。而在生物成像階段，光學(xué)顯微鏡則可以可在單粒子水平檢測納米探針的光學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)其時(shí)空動(dòng)態(tài)變化過程的成像追蹤。

 

3. 熒光納米探針典型應(yīng)用及顯微鏡解決方案

3.1 近紅外/上轉(zhuǎn)換探針 -FV3000近紅外成像解決方案

近紅外成像由于具有穿透深、光毒性小、組織自發(fā)光干擾小等優(yōu)點(diǎn)，成為現(xiàn)今光學(xué)成像的研究熱點(diǎn)。

而熒光納米探針如量子點(diǎn)，可以通過調(diào)節(jié)化學(xué)組成及形貌尺寸，輕松實(shí)現(xiàn)近紅外激發(fā)。
此外，上轉(zhuǎn)換納米材料具有受長波長(近紅外)的光激發(fā)時(shí)，可發(fā)射比激發(fā)光波長更短的光(可見光或者紫外光)的特殊光學(xué)性質(zhì)，被認(rèn)為是新一代熒光生物標(biāo)記材料之一，有望在生物醫(yī)藥、能源催化等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。
在體肝毒性的靈敏實(shí)時(shí)檢測是目前藥物性肝損傷診斷的難點(diǎn)。中國藥科大學(xué)天然藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的李會(huì)軍教授課題組2020年在Nanoscale發(fā)表的A sensitive upconverting nanoprobe based on signal amplification technology for real-time in situ monitoring of drug-induced liver injury研究論文中，設(shè)計(jì)了一種由上轉(zhuǎn)換納米粒子(upconversion nanoparticles, UCNPs)和金納米棒(gold nanorods, GNR)組裝的上轉(zhuǎn)換納米探針，并將其用應(yīng)用于藥物肝損傷的原位實(shí)時(shí)診斷。

圖3. UCNPs-H1/H2-GNR上轉(zhuǎn)換納米探針組裝應(yīng)用示意圖。

這種新型的納米探針可在肝臟內(nèi)聚集并被肝臟損傷標(biāo)志物——miR122特異性激活，在980nm近紅外光激發(fā)下產(chǎn)生800nm的熒光成像，結(jié)合發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（luminescence resonance energy transfer, LRET）效應(yīng)和信號(hào)放大技術(shù)，進(jìn)一步提高其檢測靈敏度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)miR122的高靈敏檢測，為藥物肝損傷的臨床實(shí)時(shí)監(jiān)測提供了新的思路[4]。

使用Olympus FV3000拍攝的 miR122過表達(dá)(OE)及敲除(KD)的HL7702 細(xì)胞的上轉(zhuǎn)換發(fā)光圖像[4]。

與常規(guī)共聚焦成像相比，近紅外/上轉(zhuǎn)換納米探針成像需滿足以下技術(shù)要求：

1、常規(guī)共聚焦顯微鏡的激發(fā)波長大多在400-650nm之間，而近紅外成像需要>700nm波長的近紅外激光器。

2、常規(guī)成像光路部件如掃描振鏡、物鏡、光柵等大都只在可見光范圍進(jìn)行增透/校準(zhǔn)，無法保證近紅外成像效率及準(zhǔn)確度

3、近紅外檢測需要>750nm近紅外專用檢測器。

面對(duì)以上需求，Olympus FV3000激光共聚焦顯微鏡提供了成熟系統(tǒng)的近紅外成像解決方案，致力于高靈敏、更準(zhǔn)確多色的近紅外成像。

此外，F(xiàn)V3000還可拓展ANALOG單元，將外部電壓信號(hào)記錄為圖像數(shù)據(jù)與掃描圖像同步。還可將掃描時(shí)間信號(hào)傳送到外部設(shè)備，通過BNC端口輕松實(shí)現(xiàn)與第三方外部設(shè)備的聯(lián)用，輕松實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)與電化學(xué)信號(hào)、FLIM等多模態(tài)檢測信號(hào)的同步。

 

 

3.2 腫瘤標(biāo)記物在體成像 -FVMPE-RS活體深層檢測方案

癌癥已成為世界最嚴(yán)重的公共健康問題之一，對(duì)惡性腫瘤的早期診斷及準(zhǔn)確切除也已成為目前醫(yī)學(xué)研究的重中之重。

而通過設(shè)計(jì)開發(fā)新型熒光納米探針，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤標(biāo)記物的特異性識(shí)別、高分辨在體成像，可以為惡性腫瘤的早期臨床診斷以及外科準(zhǔn)確切除提供新的檢測方案。
腫瘤細(xì)胞中的酶如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）的過度表達(dá)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和惡化的重要臨床指標(biāo)，因此對(duì)堿性磷酸酶活性的靈敏快速檢測有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和準(zhǔn)確切除。
大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 彭孝軍 院士 團(tuán)隊(duì)2020年在Angew. Chem. Int. Ed.（德國應(yīng)用化學(xué)）發(fā)表的An Activatable AIEgen Probe for High-Fidelity Monitoring of Overexpressed Tumor Enzyme Activity and Its Application to Surgical Tumor Excision的研究成果中，設(shè)計(jì)制備了一種用于堿性磷酸酶（ALP）活性成像的AIEgen探針（DQM-ALP）。
這種探針具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)，與腫瘤細(xì)胞過表達(dá)的堿性磷酸酶作用后會(huì)聚集產(chǎn)生強(qiáng)熒光，克服了常規(guī)有機(jī)染料容易聚集熒光淬滅的缺點(diǎn)，在進(jìn)一步提高檢測靈敏度的同時(shí)也提高了探針在腫瘤細(xì)胞的滯留時(shí)間。
該工作首次監(jiān)測到了丁酸鈉和皮質(zhì)醇刺激對(duì)腫瘤細(xì)胞堿性磷酸酶活性的上調(diào)作用，并通過雙光子顯微鏡實(shí)現(xiàn)了對(duì)HeLa和HepG-2腫瘤球體中堿性磷酸酶活性的高空間分辨率三維深層成像，證明了該探針可應(yīng)用于亞毫米級(jí)腫瘤的熒光檢測成像，為腫瘤的臨床診斷和手術(shù)切除提供了有力的輔助工具[5]。

圖4. DQM-ALP AIEgen探針組裝應(yīng)用示意圖。

 DQM-ALP探針標(biāo)記Hela多細(xì)胞腫瘤球體單/雙光子熒光圖像。

 

以上研究中使用了Olympus多款單/雙光子共聚焦顯微鏡，而最新 FVMPE-RS雙光子顯微鏡，專為活體深層熒光成像設(shè)計(jì)，獨(dú)家的高速掃描振鏡和高靈敏檢測光路，可在更準(zhǔn)確高效地實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤標(biāo)記物的高分辨率三維深層成像。

而雙譜線/雙激光以及最多四通道高靈敏檢測器的專業(yè)配置，可以更靈活地進(jìn)行多色同步成像，進(jìn)一步提高檢測的通量及效率。此外，獨(dú)立于成像的同步光刺激模塊，可在時(shí)間和空間上完美實(shí)現(xiàn)飛秒激光對(duì)樣品的精確空間光刺激及信號(hào)的同步快速采集，是光控、光動(dòng)力等特殊納米探針檢測的不二之選。

3.3 活細(xì)胞探針動(dòng)態(tài)檢測 –SpinSR快速超分辨解決方案

活細(xì)胞中的生物化學(xué)反應(yīng)等分子事件往往具有顯著的時(shí)空動(dòng)態(tài)特性，通過光學(xué)成像技術(shù)可精確追蹤納米探針的運(yùn)動(dòng)軌跡，研究其與生物分子的相互作用，可有效監(jiān)測其動(dòng)態(tài)變化，并進(jìn)一步探究其狀態(tài)與相關(guān)細(xì)胞功能的關(guān)系。
內(nèi)體、溶酶體等細(xì)胞器在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持代謝平衡等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，由于這些細(xì)胞器在內(nèi)吞過程中pH會(huì)發(fā)生變化，因此對(duì)這些細(xì)胞器pH值的快速靈敏檢測成為動(dòng)態(tài)監(jiān)測內(nèi)吞過程、探究其狀態(tài)與功能關(guān)系等研究的重點(diǎn)。
北京大學(xué)汪貽廣教授、德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心Gao Jinming教授團(tuán)隊(duì)2016年在Advanced Materies發(fā)表的Digitization of Endocytic pH by Hybrid Ultra-pH-Sensitive Nanoprobes at Single-Organelle Resolution論文中，設(shè)計(jì)了一種單細(xì)胞器分辨率的pH超靈敏納米探針 (HyUPS)，用于追蹤檢測內(nèi)吞過程中內(nèi)體/溶酶體等細(xì)胞器的pH變化。
該探針含有三種pH敏感的組分，對(duì)應(yīng)內(nèi)吞過程的三種組分及三個(gè)pH范圍，并分別使用紅綠藍(lán)三種熒光團(tuán)標(biāo)記。該探針成功實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)吞相關(guān)細(xì)胞器酸化速率的動(dòng)態(tài)多色實(shí)時(shí)監(jiān)測，為研究內(nèi)體/溶酶體功能障礙疾病的進(jìn)一步研究提供了新的成像工具[6]。

圖5. HyUPS納米探針檢測受體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞過程中細(xì)胞器pH變化示意圖。

使用轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡對(duì)Hela細(xì)胞中單個(gè)HyUPS納米探針標(biāo)記的內(nèi)吞細(xì)胞器實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤熒光圖像[6]。

 

對(duì)活細(xì)胞探針的成像需要借助高速成像設(shè)備，而傳統(tǒng)的點(diǎn)掃描共聚焦難以滿足這類實(shí)驗(yàn)要求。Olympus SpinSR轉(zhuǎn)盤共聚焦超高分辨成像系統(tǒng)，輕松實(shí)現(xiàn)多色超高分辨（110nm）快速（200fps）成像，適合捕捉精細(xì)結(jié)構(gòu)的快速動(dòng)態(tài)過程，堪稱生命科學(xué)研究者輕松提高成像效率的利器。獨(dú)有的RTCe（Real Time Controller）控制各部件同步工作，最大限度降低激發(fā)光對(duì)樣品的影響，配合專為深層活組織成像設(shè)計(jì)的硅油物鏡，更適合對(duì)活細(xì)胞、細(xì)胞球及類器官等樣品進(jìn)行長時(shí)間深層準(zhǔn)確成像。

 

近十幾年來, 隨著納米技術(shù)和光學(xué)成像技術(shù)的飛速發(fā)展, 基于熒光納米探針的生物化學(xué)成像應(yīng)用已取得了許多重要進(jìn)展。但是，熒光納米探針在應(yīng)用上仍然受制于其生物相容性、存在熒光閃爍行為等不足。隨著納米材料、生物成像以及化學(xué)合成、理論物理、圖像分析等學(xué)科的不斷發(fā)展、交流、融合，可望進(jìn)一步提高熒光納米探針生物成像的特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性, 使之在更多領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。

 

參考文獻(xiàn)：

[1]. Liu S., Wang Z, Xie H, Liu A, Pang D. Single-Virus Tracking: From Imaging Methodologies to Virological Applications[J]. Chemical Reviews, 2020, 120(3).

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[3]. Chen Z, Wu X, Hu S, Hu P, Liu Y. Multicolor upconversion NaLuF4 fluorescent nanoprobe for plant cell imaging and detection of sodium fluorescein[J]. J. Mater. Chem. C, 2015, 3, 153-161

[4]. Meng L, Zheng X, Zheng Z, Zhao Z, Wang L, Zhou P, Xin G, Li P, Li H. A sensitive upconverting nanoprobe based on signal amplification technology for real-time in situ monitoring of drug-induced liver injury. Nanoscale. 2020 Jul 23;12(28):15325-15335. 

[5]. Li H, Yao Q, Xu F, Li Y, Kim D, Chung J, Baek G, Wu X, Hillman P, Lee E, Ge H, Fan J, Wang J, Nam S, Peng X, Yoon J, An Activatable AIEgen Probe for High-Fidelity Monitoring of Overexpressed Tumor Enzyme Activity and Its Application to Surgical Tumor Excision. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 10186.

[6]. Wang, Y., Wang, C., Li, Y., Huang, G., Zhao, T., Ma, X., Wang, Z., Sumer, B. D., White, M. A., Gao, J., Digitization of Endocytic pH by Hybrid Ultra‐pH‐Sensitive Nanoprobes at Single‐Organelle Resolution. Adv. Mater. 2017, 29, 1603794.

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