qPCR擴(kuò)增曲線一般分成四個(gè)階段：基線期、指數(shù)期、線性期和平臺(tái)期。那么每個(gè)階段PCR產(chǎn)物量的變化都有什么區(qū)別呢？哪個(gè)階段最重要呢？小編這就一一道來。

基線期

PCR起始時(shí)，剛開始前幾個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)還沒有發(fā)生變化，接近一條直線，將其稱之為基線，一般是3-15個(gè)循環(huán)。在基線期內(nèi)，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被背景熒光信號(hào)所掩蓋，無法判斷PCR產(chǎn)物量的變化。

指數(shù)期

擴(kuò)增的熒光信號(hào)高于背景熒光信號(hào)，擴(kuò)增曲線起峰，開始進(jìn)入指數(shù)期。在指數(shù)期內(nèi)，每個(gè)循環(huán)積聚的產(chǎn)物準(zhǔn)確加倍（假定100%反應(yīng)效率）。該階段的PCR反應(yīng)具有高度特異性和精確度。因?yàn)樗�有試劑均充足，反�?yīng)的動(dòng)力學(xué)推動(dòng)反應(yīng)有利于擴(kuò)增子加倍，所以產(chǎn)物出現(xiàn)指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。只有在這個(gè)階段，Cq值與初始模板量的對數(shù)之間存在線性關(guān)系，所以在此階段進(jìn)行定量分析最合適。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應(yīng)體系各成分的消耗，其中的一種或者多種成分限制反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)開始減緩，并且每個(gè)循環(huán)的PCR產(chǎn)物不再加倍，該階段不再是指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

平臺(tái)期

反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時(shí)間夠長，PCR產(chǎn)物將開始降解。因?yàn)槊總�(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以每支試管或每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺(tái)期，最終的產(chǎn)物含量也各不相同。

由于線性期和平臺(tái)期的擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR的產(chǎn)物量與初始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以也不能通過這兩個(gè)階段的PCR產(chǎn)物量計(jì)算出初始模板量。想要知道初始模板量的多少，還要依賴指數(shù)期的Cq值進(jìn)行計(jì)算。

▲ 圖1. qPCR 反應(yīng)的重要階段
 

如圖所示，標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線是呈現(xiàn)S型的。曲線是否符合標(biāo)準(zhǔn)，不僅跟樣本起始量、qPCR體系配制、反應(yīng)程序等相關(guān)，更依賴于一套高品質(zhì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)。對于實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)來說，高度檢測靈敏度、高度重復(fù)性和高度穩(wěn)定性，是每一臺(tái)qPCR儀的追求。

高性能的Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)完全符合以上要求，該系統(tǒng)來自美國Azure Biosystems公司，融合了高品質(zhì)的帕爾特溫度模塊和基于光纖傳輸?shù)墓鈱W(xué)檢測系統(tǒng)，為您的科學(xué)研究提供高精準(zhǔn)、高靈敏可靠結(jié)果。提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。

同時(shí)配有10.3”觸控系統(tǒng)，主機(jī)本身可獨(dú)立運(yùn)行、連接、遠(yuǎn)程交互，讓您隨時(shí)隨地知悉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程和及時(shí)獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

▲ 圖2. Azure Cielo™ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)

高度的靈敏度

使用探針法，同時(shí)在Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)和其他品牌產(chǎn)品上檢測GAPDH基因，結(jié)果表明：A）Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)對單拷貝基因的檢出率更高。B）Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)的Cq平均值要低于2個(gè)Cq。

▲ 圖3. 單拷貝基因檢測對比(n=96)

高度的重復(fù)性

源于優(yōu)異的孔間均一性。105拷貝數(shù)GAPDH模板，GAPDH引物擴(kuò)增，96孔重復(fù)結(jié)果。Cq平均值=19.1，變異系數(shù)（Cv）=0.002。

▲ 圖4. 96孔重復(fù)擴(kuò)增曲線   A）線性圖  B）對數(shù)圖

高度的穩(wěn)定性

穩(wěn)定可靠的溫度模塊和光學(xué)系統(tǒng)，確保儀器連續(xù)運(yùn)行1000輪qPCR實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)依然穩(wěn)定可靠，重復(fù)性高度一致。對GAPDH進(jìn)行檢測并連續(xù)計(jì)算Cq值得出平均值和Cq值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Cq值=22.4+0.01。

▲ 圖5. 長時(shí)間連續(xù)工作數(shù)據(jù)穩(wěn)定