什么是實時熒光定量PCR（qPCR）?

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過Cq值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。
 

一．使DNA產(chǎn)物發(fā)出熒光的常用標(biāo)記方法

① 非特異性熒光染料—SYBR Green

熒光染料也稱DNA結(jié)合染料，SYBR Green 是一種結(jié)合于所有DNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。游離的SYBR Green幾乎沒有熒光信號，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大，其熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。
 

▲ 圖1. SYBR Green染料法發(fā)光原理
 

② 特異性熒光探針—TaqMan探針

qPCR中最常用的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針，該探針的5'端標(biāo)記熒光基團，3'端標(biāo)記淬滅基團。完整的探針，兩個基團的空間距離很近，淬滅基團的靠近會通過空間上的熒光共振能力轉(zhuǎn)移（FRET）而顯著降低由熒光基團發(fā)射的熒光。

PCR擴增時，探針一般先于引物結(jié)合到目的基因序列上，結(jié)合位點位于其中一個引物結(jié)合位點的下游。隨著引物的延伸通過Taq DNA聚合酶的5'外切酶活性，探針發(fā)生水解，熒光基團和淬滅基團進(jìn)行分離，從而增強了熒光基團的信號。每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，就會有更多的熒光基因從探針上脫離，熒光強度會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加。因此，根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可得出初始DNA模板的數(shù)量。
 

▲ 圖2. TaqMan探針法發(fā)光原理
 

二．熒光定量PCR系統(tǒng)如何記錄熒光信號

所有的實時熒光定量PCR系統(tǒng)都有三個共同的組成部分：溫控系統(tǒng)，光源系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。溫控系統(tǒng)用于PCR擴增，執(zhí)行高溫變性，低溫退火和中溫延伸的步驟；光源系統(tǒng)用于激發(fā)熒光染料或熒光基團，使其發(fā)出信號；檢測系統(tǒng)采集熒光信號。溫控系統(tǒng)每完成一個循環(huán)，光源和檢測系統(tǒng)則先后進(jìn)行激發(fā)和采集，從而實時記錄每一個循環(huán)熒光信號的變化。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物逐漸積累，熒光信號逐漸增強。

▲ 圖3. 實時熒光定量PCR系統(tǒng)檢測原理
 

那么Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統(tǒng)，采用了高能LED作為光源系統(tǒng)，可保證光源強度高，光源一致性好；高品質(zhì)的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統(tǒng)，升降溫速率快，可設(shè)置12列跨度30°C的溫度梯度；卓越的CMOS拍照+光纖信號傳輸作為檢測系統(tǒng)，CMOS檢測靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準(zhǔn)。
 

Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)的高配置保證為您的科學(xué)研究提供高精準(zhǔn)度、高靈敏度和高可靠性的實驗結(jié)果。

▲ 圖4. Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統(tǒng)
 

三．如何根據(jù)熒光信號得出初始模板量

實時熒光定量PCR系統(tǒng)所監(jiān)測到的所有循環(huán)的熒光信號可以繪制成一條曲線，即為熒光擴增曲線。擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)期、線性期和平臺期。指數(shù)期內(nèi)，每個循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加1倍（假定100%反應(yīng)效率），該階段的擴增反應(yīng)具有高度特異性和精確度，所以重復(fù)性好。
 

▲ 圖5. 擴增曲線
 

qPCR軟件會在指數(shù)期劃定一個閾值線，閾值線對應(yīng)一個熒光強度值，即閾值。在qPCR過程中，各擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)即是Cq值。Cq值與初始模板量的對數(shù)成線性關(guān)系。樣本初始模板量越多，熒光信號達(dá)到閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，即Cq值越小。
 

▲ 圖6. Cq值與初始模板量的關(guān)系