Digital Western Blot在領(lǐng)先靶向蛋白降解藥物公司研發(fā)中應(yīng)用
蛋白表達和功能異常調(diào)控可極大地改變細胞生理學(xué)并導(dǎo)致許多病理生理狀況如癌癥、炎癥性疾病和神經(jīng)退行性疾病等。內(nèi)源性蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)表達由從頭合成和降解速率的平衡來控制。靶向蛋白質(zhì)降解（Targeted Protein Degradation，TPD）以劑量和時間依賴性方式通過蛋白酶體對致病靶蛋白進行降解。從目前藥物研發(fā)進展來看，靶向蛋白降解的概念提供了革命性的藥物開發(fā)機會，預(yù)計將帶來現(xiàn)代小分子藥物研發(fā)的轉(zhuǎn)變。
在靶向蛋白降解領(lǐng)域，蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Western Blot，WB）是觀察細胞中濃度依賴性蛋白質(zhì)降解的經(jīng)典方法。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)印跡非常耗費資源，需要多個洗滌步驟和長孵育時間才能產(chǎn)生高質(zhì)量的印跡，導(dǎo)致技術(shù)操作復(fù)雜、通量低、定量不準和重復(fù)性差等劣勢，難以推動選擇性誘導(dǎo)、快速和可持續(xù)性的蛋白質(zhì)降解療法的快速發(fā)展。
根據(jù)藥物研發(fā)需求，工業(yè)界迫切需要建立高效、靈敏、可量化和可重現(xiàn)的蛋白質(zhì)降解技術(shù)平臺，滿足不同通量和不同研發(fā)階段需求。目前全球領(lǐng)先的靶向蛋白質(zhì)降解藥物研發(fā)公司基本建立了高低通量結(jié)合、篩選和驗證一體化的研發(fā)平臺。下面文章一窺行業(yè)領(lǐng)先的藥物公司平臺建設(shè)思路。
SLAS Discovery：C4 Tx團隊總結(jié)加速靶向蛋白降解療法開發(fā)和優(yōu)化的高通量技術(shù)
本文總結(jié)了靶向蛋白降解領(lǐng)域最常采用的從低通量到高通量的幾種不同方法。詳細說明了傳統(tǒng)Western blot、基于毛細管電泳技術(shù)的Digital Western Blot（ProteinSimple）、高通量流式細胞術(shù)（HTFC）、AlphaLISA SureFire技術(shù)、時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)技術(shù)和Nano-Glo HiBiT技術(shù)。
Digital Western Blot技術(shù)
Digital WB技術(shù)是傳統(tǒng)WB實驗系統(tǒng)的高效替代方案。使用該技術(shù)，可在同一根毛細管中完成樣品分離、捕獲、固定、免疫檢測和定量分析，從而實現(xiàn)傳統(tǒng)WB的所有實驗步驟（包括蛋白質(zhì)上樣、分離、免疫印跡、洗滌、檢測以及數(shù)據(jù)分析）自動化，有效提高蛋白質(zhì)表達定量結(jié)果的精確性和重復(fù)性。全自動Digital WB技術(shù)顯著地縮短了樣本檢測時間到3小時，直接采集化學(xué)發(fā)光或熒光信號值，利用數(shù)字化信號峰面積來表征蛋白含量，短時間內(nèi)實現(xiàn)了目的蛋白的可視化精準定量分析。ProteinSimple旗下具有系列的Digital WB系統(tǒng)，從25到96個樣本通量，可滿足靶向蛋白降解藥物研發(fā)過程中對中低通量檢測需求。
本技術(shù)可相對和絕對定量檢測目的蛋白豐度，適用于內(nèi)源性的或未修飾靶蛋白分析，如果抗體表位不受干擾，也可檢測修飾的標記過的蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)WB相比，Digital WB可實現(xiàn)高分子量蛋白質(zhì)可靠捕獲和定量分析如BRD4案例。同時，需要樣本量少，只需要3 μL上樣量，特別適用于細胞或降解劑有限的條件下，96孔板中收集處理過的細胞可滿足檢測需求。除了自動化和標準化之外，批次數(shù)據(jù)差異CV值較低，重復(fù)性好。軟件符合21 CFR Part11，數(shù)據(jù)全程可記錄。這些優(yōu)勢使其成為工業(yè)領(lǐng)域蛋白表達檢測平臺的標準配置。
高通量流式細胞術(shù)（HTFC）和In-Cell Western (ICW)
流式細胞技術(shù)可分析細胞表面和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達水平，技術(shù)進步已使流式可作為中高通量篩選方法來輔助藥物發(fā)現(xiàn)。緊湊型流式細胞儀可檢測96孔板中細胞配體或蛋白質(zhì)的不同熒光強度。本質(zhì)上，高通量流式細胞術(shù)一次檢測單個細胞，提供單個細胞信號。而ICW對孔內(nèi)所有細胞進行批量讀取。兩種方法使用比率熒光讀數(shù)來提高重現(xiàn)性和降低標準偏差，進而提高整體數(shù)據(jù)質(zhì)量。與傳統(tǒng)流式比，這兩種技術(shù)方案需要更少的樣本體積和檢測抗體可有效降低成本。但無法根據(jù)蛋白質(zhì)分子量參數(shù)來區(qū)分特異性和非特異性信號。
AlphaLISA SureFire技術(shù)
AlphaScreen是一種多功能的基于微珠相互靠近實驗技術(shù)，基于生物分子的相互作用，可測定各種分析物包括標記的或內(nèi)源性蛋白。本技術(shù)提高了檢測靈活性，微珠種類被設(shè)計識別各種不同的工程化蛋白質(zhì)標簽，或AlphaLISA每個微珠能包被針對目標蛋白不同表位的特異性抗體。當與同一蛋白質(zhì)結(jié)合時，Alpha供體和受體微珠會靠近，采用680nm近紅外光激發(fā)，供體微珠導(dǎo)致單線態(tài)氧分子釋放。單線態(tài)氧的產(chǎn)生本身不足以產(chǎn)生信號，但當受體微珠靠近時，會引發(fā)能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，進而產(chǎn)生放大的熒光信號。AlphaLISA SureFire技術(shù)采用改進光譜特性的微珠，只能進行終點分析，需要細胞裂解來觀察感興趣蛋白質(zhì)信號。對于時效性降解曲線，可通過多個高通量篩選細胞培養(yǎng)板在不同時間點裂解來實現(xiàn)。該技術(shù)優(yōu)勢是有助于更快地優(yōu)化、自動化和小型化，適用于化合物常規(guī)和高通量篩選。可減少實際操作時間和信號讀取需要的總時間，加速藥物發(fā)現(xiàn)。具有飛克級靈敏度和 4-5 log 寬動態(tài)范圍，使其適合于細胞內(nèi)、分泌或膜結(jié)合蛋白檢測。
對于靶向蛋白質(zhì)降解的細胞學(xué)實驗，384孔板可顯著縮短實驗時間。使用合適的抗體，通過使用針對靶蛋白翻譯后修飾的抗體來區(qū)分靶標蛋白。例如使用特異性識別磷酸化蛋白的抗體直接評估具有自磷酸化活性激酶的化合物BiDAC抑制和降解影響，可與總蛋白（磷酸化和未磷酸化）測量值進行比較。獲得這兩個數(shù)據(jù)可能會提高降解劑與抑制劑前體區(qū)分機制的理解，進一步了解目標蛋白調(diào)節(jié)對表型影響。
盡管有這些優(yōu)點，該技術(shù)有一些局限性。Alpha 微珠價格昂貴且對環(huán)境光高度敏感，需要在暗室環(huán)境添加實驗試劑，上機前孵育期間盡可能避免在光線下長時間暴露。此外，讀板機溫度會影響單線態(tài)氧的生成和擴散速率，每攝氏度可高達10%。為了最大限度地減少批次間差異，實驗微孔板和讀板機應(yīng)保持在溫度良好可控環(huán)境中。最后需要注意過渡金屬可導(dǎo)致單線態(tài)氧猝滅效應(yīng)。
時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)實驗
TR-FRET實驗可用于檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平變化，有助于高效快速的靶向蛋白質(zhì)降解領(lǐng)域的藥物發(fā)現(xiàn)。與AlphaLISA SureFire 技術(shù)類似，TR-FRET 是一種直接的均質(zhì)混合和讀取夾心免疫分析方法，信號檢測前不需多次洗滌步驟。通過量化兩種熒光團標記的抗體之間的比率信號來確定蛋白降解水平，這些抗體結(jié)合同一蛋白質(zhì)上的兩個不同表位，采用供體和受體熒光團標記。
TR-FRET是終點實驗，需要細胞裂解來觀察檢測感興趣蛋白質(zhì)的信號。如蛋白降解動力學(xué)曲線，必須使用多個高通量篩選細胞板并行設(shè)計TR-FRET實驗，以便裂解細胞并在每個時間點后添加檢測抗體。將這些數(shù)據(jù)疊加可提供DC50、Emax偏移以及時效曲線。對于生物標志物分析，重要的是兩種抗體使用不同表位與同一蛋白質(zhì)結(jié)合，以啟用 FRET 信號，同時將背景信號降至最低。與Alpha 技術(shù)一樣，該方法可用于測量目標蛋白質(zhì)翻譯后的抑制，從而可對通路抑制以及總蛋白質(zhì)水平進行定量。也可區(qū)別癌癥樣本突變體和正常組織中相同蛋白質(zhì)野生型具有選擇性的降解劑。本技術(shù)需要購買高質(zhì)量特異性抗體，長期藥物發(fā)現(xiàn)工作時，TR-FRET 分析每個數(shù)據(jù)點成本可能是該技術(shù)的最大缺點，盡管成本可通過批量定制標記抗體降低。TR-FRET實驗的靈活性、適應(yīng)性和可轉(zhuǎn)移性具有優(yōu)勢。一旦針對某個細胞系靶蛋白的 HTRF方法建立，通常很容易轉(zhuǎn)移到表達相同蛋白質(zhì)的其他細胞系中。HTRF技術(shù)具有寬動態(tài)范圍和信號穩(wěn)定，而無需擔心環(huán)境光的猝滅效應(yīng)。
Nano-Glo HiBiT技術(shù)
Nano-Glo HiBiT技術(shù)是一種高通量靶向蛋白質(zhì)降解藥物篩選系統(tǒng)。本技術(shù)基于分成兩部分互補NanoLuc熒光素酶系統(tǒng)，11個氨基酸的HiBiT標簽和 17.6 kD LgBiT多肽。采用 CRISPR基因編輯技術(shù)將11個氨基酸的 HiBiT標簽引入到編碼目標蛋白基因內(nèi)，或設(shè)計為可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或慢病毒感染的重組DNA表達載體，兩種方式都可實現(xiàn)將標簽與感興趣目的蛋白相連。加入特有的裂解檢測試劑，HiBiT會自發(fā)的與檢測試劑中與HiBiT互補的多肽LgBiT結(jié)合，二者結(jié)合后可形成有催化功能的NanoLuc 熒光素酶，可催化底物產(chǎn)生明亮的發(fā)光信號。該信號強度與細胞裂解物中的 HiBiT 標記蛋白含量成正比。
本技術(shù)檢測蛋白質(zhì)濃度線性范圍有幾個數(shù)量級，產(chǎn)生的發(fā)光信號可穩(wěn)定數(shù)小時，因此適用于蛋白質(zhì)降解劑藥物發(fā)現(xiàn)階段的高通量篩選。將HiBiT標簽基因編輯敲入到感興趣的蛋白質(zhì)序列中，并生成穩(wěn)定表達 HiBiT 標簽?zāi)康牡鞍椎募毎�，整個實驗開發(fā)時間至少需要3-4周。如需要挑取高表達HiBiT信號的單細胞克隆，則這個系統(tǒng)開發(fā)時間額外增加2-3周。與不需要基因編輯開發(fā)表達HiBiT細胞系技術(shù)相比，開發(fā)時間長是這種方法的一個缺點。然而，一旦產(chǎn)生穩(wěn)定表達的具有足夠信號的細胞克隆或細胞群，操作只需加樣、直接均勻混合和讀取檢測，比較簡單。
HiBiT 技術(shù)也可進行實時動力學(xué)蛋白降解檢測。LgBiT蛋白通過慢病毒轉(zhuǎn)染到已經(jīng)表達HiBiT標記的目標蛋白細胞中，同時表達HiBiT和LgBiT標簽，整個實驗過程中重組發(fā)光NanoBiT酶都存在，通過與特定底物作用來檢測信號隨時間變化值。作為單一的非裂解試劑添加步驟，持續(xù)幾分鐘到幾小時到幾天時間內(nèi)實時測量目的蛋白質(zhì)降解，所以這種方法檢測板和HiBiT試劑成本方面更具成本效益，但長時間實驗需要配置自動化系統(tǒng)。
靶向蛋白質(zhì)降解平臺建設(shè)策略
縱觀目前市面上幾種不同通量的靶向蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，每種技術(shù)都各自優(yōu)勢和相關(guān)局限性。如何構(gòu)建高效的靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)平臺來推動藥物發(fā)現(xiàn)計劃，需要注意整體策略選擇，綜合考慮成本、時間和可行性等多種因素。根據(jù)具體研發(fā)目標，選擇最可能受益技術(shù)方案。針對某些靶標蛋白可能需要采用分層篩選漏斗原理，根據(jù)C4團隊的經(jīng)驗，這種分層方法可最大限度地提高數(shù)據(jù)收集效率，以推動BiDAC降解劑早期發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化工作。各種策略前提是針對目標蛋白的抗體，及所有檢測方法和試劑都必須在化合物篩選前完整驗證。如有Nano-Glo HiBiT技術(shù)平臺，可作為快速優(yōu)化降解劑效力的高通量篩選的首選方法，它適用于終點法和連續(xù)讀取方法，以與TR-FRET相當?shù)某杀�，但提供更多的�?shù)據(jù)類型和檢測靈活性。如有針對目的靶標高度特異性且經(jīng)過驗證的抗體，同時有相關(guān)即用型試劑盒，TR-FRET是一種合適的高通量藥物發(fā)現(xiàn)工作的替代方案。TR-FRET可為表達相同目標蛋白的不同細胞系后續(xù)篩選提供有吸引力的選擇。具體那種方案作為高通量篩選階段優(yōu)先選擇，取決于研發(fā)階段和目標。
本團隊建議高通量篩選平臺需與其他技術(shù)平臺配合使用，才能更充分表征異雙功能蛋白降解劑。如采用Digital WB確認內(nèi)源性蛋白質(zhì)降解，以確保與初步篩選實驗中利用HiBiT高通量技術(shù)獲得一致性實驗結(jié)果，防止初級篩選試驗中數(shù)據(jù)結(jié)果被錯誤解讀。不管首選策略是什么，隨著未來幾年靶向蛋白降解領(lǐng)域的研究不斷加強，利用更高通量技術(shù)和更自動化平臺來加速藥物發(fā)現(xiàn)是一項有價值的投資
SLAS Discovery：C4 Tx團隊開發(fā)一種小分子誘導(dǎo)泛素化動力學(xué)檢測方法
目前大多數(shù)靶向蛋白降解化合物借助最常見的E3泛素連接酶，主要是Cullin環(huán)連接酶CRBN或VHL。化合物在E3連接酶和靶蛋白之間形成三元復(fù)合物，并促進E3連接酶催化靶蛋白泛素化，多泛素化靶蛋白隨后被細胞蛋白酶體降解。BiDACs以催化方式驅(qū)動靶蛋白泛素化，時間依賴性的誘導(dǎo)靶蛋白持續(xù)降解。作為新興的治療策略，理解蛋白質(zhì)降解的催化基礎(chǔ)對于靶向蛋白質(zhì)降解表征和效用至關(guān)重要。
依賴CRBN雙功能蛋白降解化合物（BiDAC）的催化速率是藥物發(fā)現(xiàn)過程中需要考慮的重要參數(shù)。C4基于毛細管的全自動數(shù)字化WB技術(shù)，開發(fā)了一種無細胞裂解物泛素化的體外系統(tǒng)來檢測BRD4溴結(jié)構(gòu)域1（BD1）泛素化的動力學(xué)。采用全自動Digital WB來進行BD1和BRD4泛素化水平，研究發(fā)現(xiàn) BiDAC 在泛素化速率、親和力和協(xié)同性方面存在顯著差異，并遵循快速平衡模式。此外，量化發(fā)現(xiàn)不同化合物之間泛素化模式有所不同。本研究提供一個框架來優(yōu)化BiDAC，進而提高三元復(fù)合物形成親和力和泛素化率。只有在形成穩(wěn)定的靶蛋白-BiDAC-E3泛素連接酶三元復(fù)合物時才能高效特異性泛素化靶蛋白，但三元復(fù)合物形成不一定決定泛素化率。通過檢測無細胞裂解物中BD1結(jié)構(gòu)域泛素化初始速率，來了解相同化學(xué)系列BiDAC是否在催化效率方面和熱力學(xué)參數(shù)方面差異。
下圖A中 3個化合物CFT-0251，CFT-0743和CFT-0660在不同濃度下，90min時BD1泛素化免疫印跡條帶。下圖B中用 DMSO或300nM CFT-0251處理樣品，不同時間點的BD1和 BD1_Ub代表性化學(xué)發(fā)光定量峰圖。通過Digital Western檢測在4個時間點，根據(jù)每個時間點獲得的曲線下峰面積AUC測量BD1轉(zhuǎn)化為泛素化偶聯(lián)BD1的量。90分鐘時間內(nèi)DMSO對照顯示很低背景泛素化水平。相比之下，CFT-0251在300nM濃度時泛素化水平最高，BD1在整個實驗過程中發(fā)生明顯的泛素化，進而導(dǎo)致蛋白降解。
降解標簽（dTAG）技術(shù)驗證蛋白質(zhì)降解靶標
常規(guī)的靶標確認策略包括RNAi或 CRISPR/Cas9破壞基因表達，從而導(dǎo)致細胞總蛋白水平降低 ，或使用小分子拮抗劑抑制蛋白功能。小分子藥理學(xué)方法較單純的基因方法具有許多優(yōu)勢，包括劑量依賴性效應(yīng)以及快速且可逆的作用。相比之下，基因方法提供的動態(tài)控制較少、無法確定有效劑量且通常完全不可逆。dTAG 靶標確認技術(shù)結(jié)合了基因和藥理學(xué)策略的技術(shù)優(yōu)勢，可快速提供細胞總目的蛋白豐度的劑量依賴性效應(yīng)，且在降解劑洗脫方面，這種效應(yīng)是可逆的。靶向蛋白降解劑會敲低整個蛋白質(zhì)，影響蛋白功能。因此，新的降解劑開發(fā)需要評估潛在靶點，靶點驗證是一項重要工作。dTAG降解技術(shù)提供了一種可復(fù)制推廣的策略，原則上可降解任何細胞內(nèi)感興趣的蛋白質(zhì)（POI）。它主要優(yōu)點是不依賴于蛋白配體或PROTAC的預(yù)先存在，具有廣泛地適用性，使其成為蛋白靶標發(fā)現(xiàn)和確證的有效策略。
通過CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因座特異性敲入或慢病毒轉(zhuǎn)基因表達，靶蛋白表達為一種具有 FKBP12F36V 突變體的嵌合體。dTAG-13等 dTAG 化合物由一個高選擇FKBP12F36V 配體與 E3 連接酶配體連接組成，該配體在融合蛋白和 E3 連接酶之間形成一個三元復(fù)合體，從而引起靶蛋白多聚泛素化和降解，dTAG-13 已被用來檢測和驗證癌癥新靶點。
下圖利用dTAG降解劑處理表達FKBP12F36V 融合蛋白，評估探索劑量依賴性降解反應(yīng)。利用Digital WB檢測蛋白降解水平，最高劑量500nM下觀察到最大降解。在這種情況下，與 5nM dTAG-13 處理相比，用相應(yīng)的陰性對照 (dTAG-13-NEG) 處理似乎略微降低了目標蛋白水平。A圖CRBN募集dTAG降解劑dTAG-13，B圖是VHL募集的dTAG降解劑dTAGV-1。與 dTAG-13處理一樣，觀察到劑量依賴性降解，最高測試劑量 (500 nM) 下觀察到最大降解。右圖條帶圖和峰面積圖定量數(shù)據(jù)顯示兩個dTAG降解劑之間的靈敏度差異。與 dTAG-13相比，用dTAGV-1處理后的降解更敏感，在這種情況下，dTAGV-1將用于后續(xù)實驗的首選降解劑。
采用dTAGV-1處理野生型FKBP12和FKBP12F36V 靶標2細胞，Digital WB可直接反應(yīng)融合蛋白與野生型分子量變化，同時準確檢測dTAGV-1劑量依賴性降解反應(yīng)。
通過以上案例，可知傳統(tǒng)免疫印跡方法重復(fù)性較差、定量不準確和操作時間長等技術(shù)限制，很難滿足蛋白泛素化水平檢測和靶標驗證的精準定量需求。Digital WB技術(shù)是基于毛細管電泳的快速定量免疫學(xué)檢測方法，可檢測靶蛋白和泛素化蛋白表達水平，進而準確反應(yīng)靶向蛋白降解研究過程量效關(guān)系和時效關(guān)系。Digital WB技術(shù)可靈敏地、快速地、可重復(fù)性確認內(nèi)源性蛋白降解，以確保與初步篩選實驗中高通量技術(shù)獲得一致性實驗結(jié)果，是RPOTAC技術(shù)平臺構(gòu)建的必備技術(shù)。已被GSK、Pfizer、Arvinas、Kymera therapeutics、C4 therapeutics，藥明康德和康龍化成等領(lǐng)先RPOTAC藥物研發(fā)和服務(wù)公司采用。
PROTAC 是 Arvinas, Inc. 的注冊商標，BiDAC是C4 therapeutics的注冊商標。其他商標和注冊商標是其各自所有者的財產(chǎn)，本文引自如下文獻：
1. Jeffrey R. Simard, Linda Lee etc. (2021). High-Throughput Quantitative Assay Technologies for Accelerating the Discovery and Optimization of Targeted Protein Degradation Therapeutics. SLAS Discovery. Vol. 26(4) 503–517
2. Ellen F. Vieux, Roman V. Agafonov etc. (2021). A Method for Determining the Kinetics of Small-Molecule-Induced Ubiquitination. SLAS Discovery. Vol. 26(4) 547–559
