一.背景

活細胞多色顯微熒光成像是在生物醫(yī)學基礎(chǔ)科研中常用的科研方法。活細胞培養(yǎng)熒光顯微鏡由于可以進行活細胞常規(guī)培養(yǎng)條件，例如：溫度控制、濕度控制、CO₂ 濃度控制、O₂ 濃度控制，同時配置高速攝像頭可以進行時間序列（Time-Lapse），結(jié)合多色熒光濾片切換，LED 單波長光源激發(fā)，可配備相差（Phase Contrast），微分干涉（DIC），熒光等對照方式可以更加直觀詳細的進行細胞形態(tài)記錄而受到廣大科研用戶的認可。近年來，倒置熒光顯微鏡配置活細胞培養(yǎng)裝置的相關(guān)實驗越來越普遍，目前市面上集成的熒光成像系統(tǒng)很多，例如：GE 公司的 DELTAVISION 活細胞成像系統(tǒng)，ZEISS公司的 CELL OBSERVER 系統(tǒng)，或其它大品牌公司的整套活細胞成像系統(tǒng)，價格通常20萬美元以上，且維護成本高，廠家工程師上門速度通常比較慢或者收費貴，常規(guī)實驗室難以負擔。

 
活細胞多色熒光成像技術(shù)要求：

• 由于活細胞時間序列成像時間長，通常要24小時以上，獲取細胞形態(tài)的時間序列圖片進行分析。活細胞培養(yǎng)箱需要能夠放置在顯微鏡載物臺上實時成像。要求能夠控制精確溫度，濕度，CO2濃度，O2濃度等細胞培養(yǎng)條件。
• 活細胞處于快速運動狀態(tài)，進行多色熒光成像時，需要不同熒光通道進行快速切換，傳統(tǒng)的電動熒光濾色鏡轉(zhuǎn)盤設(shè)計的電動顯微鏡通常價格昂貴，設(shè)備復雜。實驗需要一種更簡便且經(jīng)濟的解決方案。
• 活細胞熒光樣品在傳統(tǒng)的熒光光源例如汞燈或者金屬鹵化物光源照射下，光毒性作用導致細胞活性下降，而且在曝光時間過長容易照成熒光淬滅。

 
二．方案介紹
 
新型的LED光源由于其使用壽命長，發(fā)熱少，發(fā)射光強恒定且重復性好，操作簡單等優(yōu)勢成為越來越多熒光顯微鏡成像的選擇。隨著LED光源亮度加強和譜線增加，LED光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)的汞燈或者金屬氯化物光源已經(jīng)是大勢所趨。 LED光源除了使用壽命長之外,還有一個最重要的優(yōu)點即控制性好。 LED光源可即時開/關(guān)，精確的強度控制。LED光源還可以接受TTL(晶體管-晶體管邏輯電平)信號系統(tǒng)控制LED快速波長切換，允許通過多通熒光濾片進行高速多色熒光成像，無震動無濾片偏移�；�于此我們搭建的這套系統(tǒng)如下：

通過LED光源切換配合PINKEL濾片組代替熒光濾片轉(zhuǎn)盤切換通道

• 通過相機BNC端口接受TTL信號觸發(fā)

• 通過控制面板上的“Sequence Runner”模式設(shè)置LED在接受TTL信號后運行次序。

• 在OCULAR軟件界面設(shè)置相機曝光觸發(fā)光源，并且設(shè)置曝光時間。

 

• 在NIB900倒置熒光顯微鏡上加載鏡載活細胞培養(yǎng)裝置， 通過溫度控制器和氣體控制器還調(diào)節(jié)培養(yǎng)罩里面的溫度，CO2濃度，濕度，O2濃度等培養(yǎng)條件。

由于新型LED光源和相關(guān)相機聯(lián)用，多通熒光濾片等技術(shù)的成熟，廣州科適特科學儀器有限公司作為顯微鏡及顯微鏡配套的活細胞培養(yǎng)裝置，熒光光源，攝像頭等配件的供應(yīng)商。有機會搭建并且測試了一種優(yōu)惠簡便的解決方案。
 
三．測試過程
 
本測試過程采用了寧波永新NEXSCOPE NIB900倒置熒光顯微鏡主機，配置了CoolLED
公司的pE-300ultra高性能LED光源，通過100%側(cè)分光口連接Retiga R1相機，搭配了德
國ibidi公司的鏡載活細胞培養(yǎng)系統(tǒng)進行活細胞的培養(yǎng)成像。 主要測試了以下兩個方面：

• 通過Retiga R1相機通過外觸發(fā)pE-300Ultra LED光源，在相機曝光時同步打開LED光源，并且利用光源當中的”Sequence Runner”順序打開相應(yīng)的LED熒光通道，顯微鏡濾片采用Chroma公司的多通熒光濾片，進行紫外和紅色熒光的快速切換成像。通過加載活細胞培養(yǎng)裝置后，對樣品進行加熱，進行熒光測試。檢測成像的均一性和熒光強度對比。圖像均一性和熒光亮度評估。

左圖：MitoTracker Red成像(25攝氏度)     右圖：加載活細胞裝置后MitoTracker Red成像  (37攝氏度)
  左圖：無活細胞裝置DAPI成像(25攝氏度)       右圖：加載活細胞裝置后DAPI成像(37攝氏度)

• 通過加載活細胞培養(yǎng)裝置后，對樣品進行加熱，進行明場測試。檢測成像的均一性和熒光強度對比。

左圖：無活細胞裝置明場病理片成像(25攝氏度)  右圖：加載活細胞裝置后明場病理片成像(37攝氏度) 左圖：無活細胞裝置明場病理片成像(25攝氏度)  右圖：加載活細胞裝置后明場病理片成像(37攝氏度)
 
四．分析測試結(jié)果

• 通過NIB900直接連接pE-300系列LED光源可以獲得良好的熒光強度和圖像均一性。
• 可以通過相機曝光觸發(fā)實現(xiàn)光源同步開關(guān)，可以通過曝光時間控制光源打開時間，減少樣品過度曝光導致的熒光淬滅。
• 通過LED光源的內(nèi)置Sequence Runner設(shè)置芯片依次曝光的順序，實現(xiàn)TTL觸發(fā)LED光源通道切換代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光濾片轉(zhuǎn)盤切換。提高切換速度，避免震動和濾片漂移問題。
• 鏡載活細胞可以精確控制活細胞培養(yǎng)條件，德國ibidi活細胞培養(yǎng)裝置放置在NIB 900顯微鏡上可以精確對焦，不影響明場和熒光顯微成像效果。能夠搭配同時使用。 

五．測試配置方案

• 倒置熒光顯微鏡主機：NEXSCOPE NIB900
• 活細胞培養(yǎng)裝置：ibidi Heating incubator(德國 ibidi)
• 顯微鏡LED光源：CoolLED pE-300Ultra(英國 CoolLED)
• 攝像頭及軟件：Photometrics Retiga R1帶BNC觸發(fā)線, Ocular V2.0.1(加拿大 Photometrics)
• PINKEL 濾片：Chroma 69401 （美國 Chroma）
• 樣品：invitrogen FLuocells #1 BPAE cells (美國 Invitrogen)

六．總結(jié)

1.搭建的活細胞培養(yǎng)裝置各部分整合良好，可以比較經(jīng)濟的方式實現(xiàn)順暢的活細胞多色熒光成像。

2.寧波永新NEXSCOPE NIB900具有很高的光學質(zhì)量，具有DIC，相差，熒光多重功能，配置了三個攝像接口（100%/0；20%/80%;0:100%）。在成像均勻性，色差還原，物鏡表現(xiàn)，主機擴展性方面表現(xiàn)良好，與進口顯微鏡同檔次無明顯差別，屬少見的國產(chǎn)研究級顯微鏡精品。

3.相對常規(guī)的活細胞成像系統(tǒng)，此方案采用新型LED光源，對細胞光毒性較小，適合活細胞樣品的時間序列成像。

4.相機曝光觸發(fā)光源同步開關(guān)，減少非必要的熒光樣品和活細胞的照射導致的光漂白和光毒性。

5.相對于常規(guī)的活細胞成像系統(tǒng)，此方案通過相機曝光輸出的TTL信號切換熒光通道。無需濾片轉(zhuǎn)盤切換，減少了顯微鏡震動和濾片漂移導致多通道疊加偏差。

6.活細胞培養(yǎng)裝置中溫度控制是一個重要的實驗參數(shù)，但是由于活細胞培養(yǎng)的探測器通常位于培養(yǎng)腔室的上壁邊緣，由于室溫（例如 22℃）與培養(yǎng)箱中設(shè)定溫度（例如 37℃）偏差比較大，溫度傳導散熱效應(yīng)，為了保證真實培養(yǎng)溫度精確，顯微鏡活細胞培養(yǎng)在不同的實驗室環(huán)境首次使用前通常需要進行校準。

7.配件可以單獨增加或者拆卸，有利于減少實驗預算，提高顯微鏡和配件的使用效率。

8.此方法采用相機觸發(fā)LED光源順序開關(guān)LED通道，配合多通熒光濾片可以實現(xiàn)傳統(tǒng)的系統(tǒng)活細胞多色熒光成像功能。并且可以獲得更好的時間方便率。切換速度更快，適合活細胞樣品多重熒光成像。
9.由于缺乏活細胞樣品，有些功能比如活細胞時間序列，微分干涉觀察，相差成像等此次沒有完成測試，等有條件后續(xù)進行。