2021年3月2日，云序客戶空軍軍醫(yī)大學(xué)張瑞以及楊安鋼共同通訊在Nature Communications 上在線發(fā)表題為”RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming”的研究論文，該研究運(yùn)用云序生物m6A-meRIP-seq的方法發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞中Mettl3的敲除可促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并闡明了該過程的分子機(jī)理。該結(jié)果為尋找腫瘤免疫治療靶點(diǎn)提供了一個(gè)新的方向。
 
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：12.121
研究方法：m6A- meRIP-seq、meRIP-qPCR等
文章鏈接：RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming


研究?jī)?nèi)容
（1）骨髓特異性的Mettl3缺失促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
為了研究m6A修飾在巨噬細(xì)胞中的作用，作者將WT BMDMs(骨髓源性巨噬細(xì)胞)與B16細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)Mettl3的表達(dá)明顯減少。為了研究骨髓細(xì)胞中的Mettl3是否能夠調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)程。作者將Mettl3fl/fl小鼠與Lyz-cre小鼠雜交敲除了髓腔室中的Mettl3。然后，對(duì)Mettl3fl/flLyz2+/+ (WT)和Mettl3fl/flLyz2cre/+ (KO)小鼠的BMDMs和腹腔巨噬細(xì)胞(PMs)進(jìn)行qRT-PCR和western blotting檢測(cè)。結(jié)果表明，來自KO小鼠的BMDMs和BM中Mettl3 mRNA表達(dá)分別下降了約75%和80%。此外，KO BMDMs中mRNA上m6A修飾水平低于WT。作者將B16或LLC細(xì)胞皮下注射到WT或KO小鼠中，KO小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于WT小鼠，這些敲除Mettl3小鼠的生存時(shí)間縮短(圖1a-d)。通過尾靜脈將B16或LLC細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)，生物發(fā)光成像顯示，與WT小鼠相比，KO小鼠的肺轉(zhuǎn)移增強(qiáng)(圖1e, f)。組織學(xué)檢查顯示，與WT小鼠相比，KO小鼠有更大、更多的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)且Ki67染色增加(圖1g-j)，導(dǎo)致KO小鼠比WT小鼠總生存時(shí)間縮短(圖1k)。此外，與正常組織中的巨噬細(xì)胞相比，TAMs中Mettl3的表達(dá)減弱（圖1 l)。上述結(jié)果說明Mettl3在骨髓細(xì)胞中的缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和增殖。

為了探討B(tài)MDMs中Mettl3的缺失是否會(huì)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，作者建立了巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的混合模型。用CFSE標(biāo)記BMDMs，并將B16或LLC細(xì)胞共注入小鼠皮下F4/80免疫熒光染色結(jié)果顯示CFSE標(biāo)記的細(xì)胞共注射BMDMs可在腫瘤中存活2周。進(jìn)一步的分析表明，B16或LLC細(xì)胞與KO BMDMs共注射可加速腫瘤的生長(zhǎng)(圖2a-f)。接下來，在實(shí)驗(yàn)前兩天通過靜脈注射氯膦酸脂質(zhì)體來減少小鼠的巨噬細(xì)胞，然后將B16細(xì)胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，生物發(fā)光成像顯示，巨噬細(xì)胞耗竭消除了WT和KO小鼠腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的差異(圖2g, h)，并通過肺腫瘤組織學(xué)分析證實(shí)了這一點(diǎn)(圖2i, j)。消耗了巨噬細(xì)胞的小鼠的生存期得到延長(zhǎng)，用氯膦酸脂質(zhì)體處理的WT和KO小鼠之間沒有明顯差異(圖2k)。綜上所述，巨噬細(xì)胞中METTL3在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

（2）巨噬細(xì)胞中Mettl3的缺失通過增強(qiáng)M1-和M2-like TAM和Treg對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)來重塑腫瘤微環(huán)境。
為了評(píng)估Mettl3對(duì)免疫微環(huán)境的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)脾和肺進(jìn)行免疫表型分型，發(fā)現(xiàn)KO小鼠的M1巨噬細(xì)胞， M2巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的總體百分比增加。為了進(jìn)一步研究Mettl3對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響，通過單細(xì)胞RNA測(cè)序分析了WT或KO小鼠腫瘤中的CD45+細(xì)胞。KO小鼠的腫瘤與WT小鼠的腫瘤在免疫細(xì)胞的組成上存在差異，包括TAMs、MDSCs和CD4+的數(shù)量增加，T細(xì)胞以及粒細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞數(shù)量減少的趨勢(shì)。此外，通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)含有mettl3-缺陷巨噬細(xì)胞的腫瘤組織進(jìn)行免疫表型分析，發(fā)現(xiàn)M1-和M2-like TAMs總體百分比增加(圖3a)。此外，MDSCs和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量有增加的趨勢(shì)(圖3b-d)。先前的研究表明，Treg在各種腫瘤組織中的遷移和浸潤(rùn)似乎依賴于腫瘤細(xì)胞或浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的CCR4配體(CCL22)的表達(dá)。通過qRT-PCR和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在mettl3缺失的BMDMs和TAMs中，CCL22表達(dá)明顯上調(diào)(圖3e, f)。作者研究了注射抗CD25抗體對(duì)Treg水平的影響，發(fā)現(xiàn)Treg水平有75%的下降。隨著Treg細(xì)胞數(shù)量的減少，Th1細(xì)胞和IFN-γ+ CD8 T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞中增加，而Th2細(xì)胞基本未受影響。進(jìn)一步分析表明WT和接受抗CD25抗Treg消除抗體的KO小鼠在腫瘤生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移方面沒有明顯差異，但與WT小鼠相比，在未處理組，KO小鼠的腫瘤生長(zhǎng)增加(圖3g-k)。去掉Treg后，WT和KO小鼠的存活率差異也消失了(圖3l)。這些數(shù)據(jù)表明髓系細(xì)胞中Mettl3的缺失促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其方式依賴于M1/M2-like TAM浸潤(rùn)和Treg募集。

（3）Mettl3敲除通過NF-kB / STAT3軸促進(jìn)BMDMs中M1和M2極化。
為了研究Mettl3在巨噬細(xì)胞極化中的潛在作用，使用LPS和IFN-γ誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞或IL-4誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞。qRT-PCR檢測(cè)了M1和M2巨噬細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在mettl3缺失的BMDMs中TNF-α、IL-6和Arg1的表達(dá)明顯上調(diào)(圖4a)。ELISA還發(fā)現(xiàn)Mettl3缺失的BMDMs中TNF-α和IL-6表達(dá)上調(diào)，IL-10表達(dá)相對(duì)不變(圖4 b)。在Mettl3缺失的BMDMs中也觀察到精氨酸酶活性的增加(圖4c)。在BMDMs中評(píng)估了p65，觀察到p65和STAT3磷酸化水平在mettl3缺失的巨噬細(xì)胞中升高(圖4d)。NF-κB的抑制降低了TNF-α、IL-6和Arg1，而抑制STAT3通路降低了WT和KO BMDMs中Arg1的表達(dá)(圖4 e)。芯片分析表明p-STAT3特異性結(jié)合到Arg1的啟動(dòng)子上(圖4f)。接下來從攜帶腫瘤的小鼠中收獲并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TAMs結(jié)果顯示，KO TAMs中M1和M2巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)同時(shí)增加，這與p65和STAT3磷酸化和ARG1表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)(圖4g-i)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明Mettl3的缺失導(dǎo)致NF-κB通路和STAT3信號(hào)通路的激活，從而導(dǎo)致M1和M2-like巨噬細(xì)胞極化。



（4）腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并在mettl3敲降巨噬細(xì)胞中激活NF-κB和STAT3。

由于NF-κB和STAT3可受細(xì)胞外源性因子TNF-α或IL-6刺激BMDMs調(diào)節(jié)。免疫印跡結(jié)果顯示，KO BMDMs誘導(dǎo)p-p65和p-STAT3的能力比WT更明顯。qRT-PCR分析顯示TNF-α處理后TNF-α和IL-6的表達(dá)增加，通過bay11-7082阻斷NF-κB通路后逆轉(zhuǎn)，而IL-6作用后，Arg1的表達(dá)增加，通過STAT3抑制劑S3I-201處理后逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果提示，NF-κB/IL-6/STAT3信號(hào)軸在KO BMDMs中比WT BMDMs更活躍。
為了評(píng)估NF-κB/IL-6/STAT3信號(hào)軸在腫瘤微環(huán)境中的作用，將B16或LLC細(xì)胞與BMDMs孵育，發(fā)現(xiàn)IL-6在B16和LLC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，p65磷酸化水平增加，并通過bay11 -7082阻斷NF-κB通路后逆轉(zhuǎn)(圖5a)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TNF-α治療不僅增加了p65的磷酸化也增加IL-6的表達(dá)，用NF -κB抑制劑處理可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中IL-6的表達(dá)(圖5b)。此外，WT或KO BMDMs用bay11 -7082或抗TNF-α抗體前處理然后與B16或LLC細(xì)胞共培養(yǎng)。qRT-PCR分析顯示，bbay11 -7082或抗TNF-α抗體的加入抑制了IL-6的表達(dá)(圖5c)，伴隨p65和STAT3磷酸化降低(圖5 d)。此外，在mettl3缺失的BMDMs與B16或LLC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，與WT BMDMs相比，Arg1的表達(dá)明顯降低(圖5e, f)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，mettl3缺失的巨噬細(xì)胞通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子反應(yīng)重塑了腫瘤微環(huán)境。

（5）METTL3的缺失會(huì)損害YTHDF1介導(dǎo)的SPRED2翻譯。
探討m6A在巨噬細(xì)胞重編程中的作用，對(duì)WT和KO BMDMs進(jìn)行了m6A meRIP-seq，生信分析得到了m6A峰密度圖(圖6a)，Motif分析發(fā)現(xiàn)了m6A修飾的保守Motif“GGAC”(圖6b)。為確定m6a調(diào)控的巨噬細(xì)胞極化潛在的目標(biāo)基因，作者在MAPK通路相關(guān)基因和70個(gè)m6A下調(diào)基因中取交集獲得候選基因。在這些基因中，Spred2上m6A水平明顯降低(圖6c, d)。此外，meRIP-qPCR 證實(shí)Spred2是m6A調(diào)控的靶基因(圖6e)。隨后在KO BMDMs和TAMs中發(fā)現(xiàn)，SPRED2蛋白表達(dá)降低，而mRNA水平?jīng)]有明顯改變(圖6f)。mRNA衰減實(shí)驗(yàn)表明，m6A修飾對(duì)Spred2的衰減沒有明顯影響(圖6g)。因此推測(cè)在Mettl3缺失的BMDMs中，SPRED2蛋白表達(dá)的下調(diào)可能是由于YTHDF1控制的蛋白質(zhì)翻譯效率的差異所致。
然后作者通過多聚體分析WT和KO BMDMs將RNA分成非翻譯部分，翻譯起始部分和翻譯活性多聚體(圖6h)。qRT-PCR結(jié)果顯示，mettl3缺失的BMDMs翻譯活性多聚體中Spred2 mRNA水平明顯低于WT BMDMs(圖6i)。然后檢測(cè)了METTL3是否被招募到Spred2啟動(dòng)子中并影響Spred2的表達(dá)，結(jié)果表明野生型METTL3 和催化死亡突變體METTL3可影響熒光素酶活性。為了研究CDS中m6A甲基化是否能調(diào)控SPRED2的表達(dá)，將m6A修飾保守位點(diǎn)GGAC突變?yōu)镚CTC (SPRED2 -CDS mut1或SPRED2 -CDS mut2)或同時(shí)突變(SPRED2 -CDS mut1/2)。其中Spred2-CDS mut2和Spred2-CDS mut1/2降低了SPRED2水平而Spred2-CDS mut1沒有，這表明Spred2-CDS mut2中的m6A基序是表達(dá)調(diào)控的主要位點(diǎn)(圖6j, k)。此外，RNA-IP結(jié)果顯示，YTHDF1和Spred2在Mettl3 KO植株中互作下降。為了證實(shí)YTHDF1在m6a調(diào)控SPRED2表達(dá)中的作用，在BMDMs中下調(diào)了YTHDF1的表達(dá)。YTHDF1基因敲除明顯減弱SPRED2在BMDMs中的表達(dá)，增加了ERK, NF-κB和STAT3磷酸化。qRT-PCR分析顯示，YTHDF1敲除后Tnf-α、Il-6、Arg1和Ccl22的表達(dá)增加。此外，BMDMs中SPRED2的下調(diào)導(dǎo)致ERK、NF-κB和STAT3磷酸化上調(diào)，并伴有Tnf-α， Il-6, Arg1和Ccl22上調(diào)表達(dá)�？偟膩碚f，BMDMs中Mettl3的丟失導(dǎo)致BMDMs中ythdf1介導(dǎo)的SPRED2的翻譯和ERK, NF-κB和STAT3磷酸化。

（6）髓系細(xì)胞中Mettl3的缺失會(huì)損害PD-1阻斷治療B16黑色素瘤的療效。
為了評(píng)估靶向METTL3激活抗腫瘤反應(yīng)的潛力，在B16腫瘤轉(zhuǎn)移模型中測(cè)試了抗PD-1治療。正如預(yù)期的那樣發(fā)現(xiàn)在KO小鼠中，B16腫瘤對(duì)抗pd -1治療的反應(yīng)較低，這增加了腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移，縮短了生存時(shí)間(圖7a-f)。說明Mettl3缺乏的髓系細(xì)胞參與了B16腫瘤對(duì)抗PD-1治療產(chǎn)生耐藥性。

總結(jié)
這篇文章結(jié)合m6A meRIP-seq、 meRIP-qPCR等實(shí)驗(yàn)手段探究了甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的髓樣特異性缺失對(duì)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，揭示了Mettl3確實(shí)可通過影響巨噬細(xì)胞重編程增強(qiáng)小鼠腫瘤模型中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并減弱PD-1阻斷療法。該研究表明巨噬細(xì)胞中的m6A甲基化酶是潛在的癌癥治療靶標(biāo)，為靶向治療癌癥提供了新的思路。
 

云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測(cè)序
m6A RNA修飾測(cè)序（m6A-seq）
對(duì)m6A RNA甲基化，目前流行的檢測(cè)手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測(cè)序：

• m6A 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA測(cè)序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA測(cè)序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA測(cè)序
• m6A  miRNA測(cè)序

02 檢測(cè)整體m6A RNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測(cè)整體RNA修飾水平
精準(zhǔn)高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)，9類修飾水平檢測(cè)，一步到位。
比色法
快速檢測(cè)m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
 m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗(yàn)證
 meRIP-qPCR
云序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對(duì)mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類型的RNA分子進(jìn)行檢測(cè)，低通量驗(yàn)證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。
05機(jī)制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。

云序生物服務(wù)優(yōu)勢(shì)
優(yōu)勢(shì)一：發(fā)表10分以上文章zui多的m6A RNA甲基化測(cè)序服務(wù)平臺(tái)。云序已累計(jì)支持客戶發(fā)表42篇高水平文章，合計(jì)影響因子300分+，是國內(nèi)支持發(fā)文多、累計(jì)影響因子高的公司。
優(yōu)勢(shì)二：至今完成4000+例 m6A測(cè)序樣本，覆蓋醫(yī)口、農(nóng)口等各類樣本。
優(yōu)勢(shì)三：檢測(cè)mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
優(yōu)勢(shì)四：提供m6A一站式服務(wù)：m6A整體水平檢測(cè)、m6A測(cè)序、MeRIP-qPCR驗(yàn)證、RIP和RNA pull-down。
優(yōu)勢(shì)五：率先研發(fā)超微量MeRIP測(cè)序，RNA量低至500ng起。
優(yōu)勢(shì)六：國內(nèi)zui全的RNA修飾測(cè)序平臺(tái)，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化測(cè)序。