100多年前德國解剖學(xué)家Werner Spalteholz發(fā)表了關(guān)于生物醫(yī)學(xué)樣品進(jìn)行組織透明化處理的最早報(bào)告，首次成功地觀察到透明樣品的宏觀結(jié)構(gòu)^[1]。隨著最先進(jìn)的組織透明化方法和3D成像技術(shù)的出現(xiàn)方法，科研人員已經(jīng)能夠以細(xì)胞到亞細(xì)胞的分辨率全面觀察單個器官或組織甚至單個生物體。而收集細(xì)胞的相關(guān)生物信息需要根據(jù)組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和細(xì)胞活性進(jìn)行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記^[2]。
 
經(jīng)典的免疫熒光和熒光原位雜交分別標(biāo)記蛋白質(zhì)和mRNAs的方法，最常用于薄組織切片中，熒光結(jié)合的大分子在其中可以快速擴(kuò)散。通常小組織可以很容易地用分子探針（如抗體）染色；然而，就像所有依賴被動擴(kuò)散的組織處理方法一樣，大組織的染色需要更長的孵育時間，因此即使在脫脂或水凝膠包埋后，探針也需要數(shù)周或數(shù)月才能徹底穿透大樣本^[3]。
 
此外，在傳統(tǒng)的被動標(biāo)記方法中，用于標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)參數(shù)（例如孵育時間、探針量）高度依賴于樣品性質(zhì)（例如組織類型、大小、形狀）和靶蛋白性質(zhì)（例如表達(dá)水平、分布模式），因此，每個實(shí)驗(yàn)都需要費(fèi)力、昂貴和耗時的優(yōu)化。被動標(biāo)記的結(jié)果在許多情況下是高度不均勻的，外部區(qū)域標(biāo)記飽和，核心區(qū)域標(biāo)記較弱甚至沒有標(biāo)記^[4]。因此，設(shè)計(jì)允許抗體（用于免疫熒光）和寡核苷酸（用于原位雜交）滲透到完整器官或同等大小的組織樣本中的方法仍然具有挑戰(zhàn)性。
 
為了解決這一局限性，麻省理工Dr. Kwanghun Chung課題組開發(fā)了一種稱為SHIELD（stabilization under harsh conditions via intramolecular epoxide linkages to prevent degradation）的方法，以保存器官級透明組織中蛋白質(zhì)的熒光、蛋白質(zhì)抗原性、轉(zhuǎn)錄物和組織結(jié)構(gòu)^[5]。SHIELD使用聚環(huán)氧化合物通過形成分子內(nèi)和分子間交聯(lián)來保護(hù)生物分子的物理化學(xué)性質(zhì)（例如，蛋白質(zhì)熒光和抗原性）。經(jīng)SHIELD固定和脫脂的組織可以承受苛刻的抗體脫色條件，因此可以對同一樣本進(jìn)行多輪染色和成像。
 

圖1. 2018年SHIELD榮登《Nature Biotechnology》的封面
 
此外，Dr.Chung課題組發(fā)展的一系列技術(shù)：為了在不損害組織完整性的前提下加速分子標(biāo)記，發(fā)展了一種新的分子轉(zhuǎn)運(yùn)模式，稱為隨機(jī)電泳技術(shù)（Stochastic electrotransport）^[6]，可快速將抗體、染料輸送到致密的組織凝膠中，并允許在2或3天內(nèi)對完整的小鼠器官進(jìn)行均勻的染色（而在依賴被動擴(kuò)散的方法中，則是數(shù)周到數(shù)月）。為了確保免疫標(biāo)記的一致性，采用SWITCH技術(shù)在整個樣品中同步化學(xué)反應(yīng)。該方法有兩個基本步驟^[7]：（1）SWITCH-OFF，當(dāng)化學(xué)物質(zhì)和緩沖液在組織中自由擴(kuò)散時，化學(xué)反應(yīng)被抑制；（2）SWITCH-ON，當(dāng)緩沖環(huán)境迅速改變到允許化學(xué)反應(yīng)的條件時，就可以啟動。以這種方法，組織結(jié)構(gòu)、天然生物分子和抗原性被高度保留，且允許多達(dá)≥20輪標(biāo)記。


圖2. 隨機(jī)電泳技術(shù)展示對完整的大腦進(jìn)行均勻和完全的染色
（A、E：主動式隨機(jī)電泳；B、F：被動式）



圖3. SWITCH技術(shù)展現(xiàn)強(qiáng)大的多輪染色能力

     
通過結(jié)合以上這些強(qiáng)大的技術(shù)，LifeCanvas主動式染色儀器SmartLabel（锘海代理）可實(shí)現(xiàn)從表面到核心均勻的全器官抗體標(biāo)記，它的優(yōu)勢還不僅如此：

• 快速：與被動標(biāo)記相比，標(biāo)記完整大組織樣本（例如嚙齒動物器官）要快一個數(shù)量級（≤48小時vs.數(shù)周至數(shù)月）。
• 簡便：只需加載緩沖液、樣品及探針。雙樣本倉設(shè)計(jì)，可以同時執(zhí)行2個不同的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
• 高效：使用少量抗體（低至〜3 µg）即可標(biāo)記完整小鼠大腦。
• 可靠：利用隨機(jī)電泳技術(shù)防止組織損傷。專利的納米半透膜有效消除組織污染和探針損失。
• 環(huán)境友好型：緩沖液可以安全地排入下水道。

視頻：采用SmartLabel對小鼠全腦標(biāo)記NeuN抗體

參考文獻(xiàn)
[1] Ueda HR, Dodt HU, Osten P, Economo MN, Chandrashekar J, Keller PJ. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 2020;106(3):369-387.
[2] Susaki EA, Shimizu C, Kuno A, et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nat Commun. 2020;11(1):1982.
[3] Ueda HR, Ertürk A, Chung K, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience [published correction appears in Nat Rev Neurosci. 2020 May;21(5):298]. Nat Rev Neurosci. 2020;21(2):61-79. 
[4] Yun D H , Park Y G , Cho J H , et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. 660373.
[5] Park YG, Sohn CH, Chen R, et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nat Biotechnol. 2018;10.1038/nbt.4281.
[6] Kim SY, Cho JH, Murray E, et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(46):E6274-E6283. 
[7] Murray E, Cho JH, Goodwin D, et al. Simple, Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 2015;163(6):1500-1514.