超敏一步巢式Taqman qPCR熒光核酸檢測技術的機理及應用優(yōu)勢
巢式PCR具有很高的靈敏度和特異性，但傳統(tǒng)的巢式PCR采用兩對引物，通過兩輪PCR，進行目標產物的擴增。這種操作的不便性，使得其高靈敏度的特性難以應用到快速檢測和臨床診斷中。在單管巢式PCR的擴增中，由于內側引物會阻礙外側引物的擴增，因此標準的Taq DNA聚合酶不能在單管巢式PCR的擴增中，發(fā)揮其高靈敏度的特性。采用耐高溫、且具有鏈置換活性的聚合酶，可保證在單管反應中，內外兩側引物同時擴增，巢式PCR才能達到真正意義上的高靈敏度。一步法巢式PCR（One-Step Nested PCR）技術最早報道于2013年，雖然其擁有高靈敏度的檢測特性，但始終未能在核酸檢測領域獲得廣泛應用。其主要原因是SD聚合酶的鏈置換活性過于強烈，而導致外切酶活性作用的機會太弱，導致高信噪比的TaqMan探針無法應用于One-Step Nested PCR。因此，One-Step Nested PCR的熒光探針檢測只能依靠特異性和信噪比欠佳的發(fā)卡FRET探針。
憑借在分子工具酶改造工作中積累的的豐富經驗，開發(fā)出具有探針切割活性的SD 2.0 DNA Polymerase和SD 3.0 DNA/RNA Polymerase，結合獨有的P-Bond錨定探針技術，將高信噪比的TaqMan探針應用到One-Step Nested PCR上，建立起了TaqMan One-Step Nested qPCR方法。運用TaqMan One-Step Nested PCR方法檢測DNA或RNA分子，在檢測靈敏度和擴增速度方面，都是傳統(tǒng)TaqMan PCR法難以企及的。因此，TaqMan One-Step Nested PCR技術將是未來基因檢測市場爭奪戰(zhàn)中的最有利武器之一。
一、One-Step Nested PCR 高靈敏度機理
在標準PCR過程中，使用上游和下游兩條引物對靶基因進行熱循環(huán)擴增，每經過一個循環(huán)的擴增，產物最多變?yōu)?倍。而在One-Step Nested PCR(或稱為PCDR法，Polymerase Chain Displacement Reaction)的擴增中由于使用兩條上游引物和兩條下游引物，因此在每次熱循環(huán)過程中，產物增加近4倍，在經過30-40次循環(huán)后，核酸產物將會高于PCR法成千上萬倍，并且所需的循環(huán)數(shù)更少。在核酸檢測的實驗中，One-Step Nested PCR法比標準PCR法靈敏度要高10-100倍，并且更容易開發(fā)出高靈敏的檢測試劑盒。
二、TaqMan One-Step Nested qPCR熒光法核酸檢測技術
TaqMan One-Step Nested qPCR技術是在PCDR的基礎上，研發(fā)團隊利用具有探針切割活性的SD2.0或SD3.0 DNA/RNA聚合酶，結合獨特的P-Bond探針錨定技術開發(fā)的一項新的核酸檢測技術。該技術較目前核酸檢測工作中常用的Taqman qPCR技術，在靈敏度和擴增速度上，具有極大的優(yōu)勢，因此該技術在目前和未來的核酸檢測領域具有極大的推廣和應用價值。
TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的性能對比
| TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的性能對比 | ||
| TaqMan PCR | TaqMan One-Step Nested PCR | |
| 擴增引物數(shù) | 兩條 | 四條或六條 |
| 探針 | 雙標熒光探針 | 雙標P-Bond熒光探針 |
| 熱循環(huán)倍增數(shù) | <2 | >2 |
| 擴增條件 | 熱變性循環(huán) | 熱變性循環(huán) |
| 檢測設備 | 標準定量PCR儀 | 標準定量PCR儀 |
| 數(shù)據(jù)判讀方式 | 擴增曲線或Ct值 | 擴增曲線或Ct值 |
| 對模板變異敏感度 | 較敏感 | 不敏感 |
| 5 copy靈敏度 | 開發(fā)難度大，判讀困難 | 開發(fā)容易，判讀容易 |
| 5 copy Ct值 | 通常>34 | 通常<28 |
| DNA擴增用酶 | Taq | SD 2.0 |
| RNA擴增用酶 | Taq+MLV、TTx、mTTx、Z05 | SD 3.0 |
三、TaqMan One-Step Nested qPCR熒光法核酸檢測技術應用策略
在TaqMan One-Step Nested PCR的實驗中，采用4條擴增引物的情況下，檢測靈敏度和擴增速度較傳統(tǒng)TaqMan PCR法會大幅提高。同時，由于采用了4條擴增引物，當在檢測變異度較高的RNA病毒時，突變對擴增引物的影響顯著降低，從而避免了漏檢的可能性。當再增加一條檢測探針時，對突變的敏感度進一步降低，此時已經與TaqMan PCR的雙重檢測防止漏檢的設計完全相同，但One-Step Nested PCR法檢測靈敏度更高。為了進一步提高檢測靈敏度和擴增速度，可以再增加一對擴增引物，采用6引物進行擴增。
圖：TaqMan One-Step Nested PCR引物和探針設計原理
四、TaqMan One-Step Nested qPCR的引物和探針設計原則
| 表 TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的引物設計參數(shù)對比 | ||
| TaqMan PCR | TaqMan One-Step Nested PCR | |
| 擴增引物長度 | 18-26bp，條件完全相同 | |
| 擴增引物TM值 | 55-60℃，條件完全相同（GC含量40-60%最佳 | |
| 探針長度 | 20-35bp | 20-28bp |
| 探針TM值 | 一般68℃（>引物10℃） | 一般63℃（>引物3-5℃） |
| 擴增片段大小 | <200bp | <300bp（外側） |
| <150bp（內側） | ||
| 探針位置 | 與引物3’端間隔2-6bp | 與引物3’端間隔4-20bp |
五、TaqMan One-Step Nested PCR的擴增性能展示
1.以非洲豬瘟DNA病毒核酸檢測為例，進行TaqMan One-Step Nested PCR與TaqMan PCR兩種方法性能的比較。
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| 圖A：傳統(tǒng)的TaqMan PCR法對10copy以下模板檢測困難， 通常Ct>35，不易判讀。 |
圖B：TaqMan One-Step Nested PCR法5copy的 DNA模板Ct<26，單copy分子Ct<30. 結果易于判讀。 |
2.以2019-CoV RNA病毒核酸檢測為例，應用TaqMan One-Step Nested PCR進行檢測。
圖A:針對2019-CoV的N基因使用的引物、探針策略圖示
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| 圖B：2019-CoV的N基因靶標區(qū)段1（FAM通道）靈敏度測試 | 圖C：2019-CoV的N基因靶標區(qū)段2（HEX通道）靈敏度測試 |
3.TaqMan One-Step Nested PCR用于SNP或變異毒株的分型檢測。
圖A:針對2019-CoV的S基因的D614G突變使用的引物、探針策略圖示
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| 圖B：2019-CoV病毒 D614G分型結果 |
圖C：2019-CoV病毒D614（野生型） 靈敏度測試 |
圖D：2019-CoV病毒G614（突變型） 靈敏度測試 |
