在做qPCR實驗時，我們經(jīng)常會問：“你是做絕對定量還是相對定量呢？”，而定量方法的選擇是取決于實驗的目標(biāo)。絕對定量可測定目標(biāo)核酸分子的實際拷貝數(shù)，但也是最費力、最復(fù)雜的定量形式。此方法要求周密的實驗方案和高度準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線，常用于確定病毒滴度。

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線進行絕對定量

絕對定量是通過樣品的Cq值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較實現(xiàn)的。首先為了建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要已知拷貝數(shù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，對標(biāo)準(zhǔn)品進行5次以上的連續(xù)梯度稀釋，將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進行實時熒光定量PCR擴增，最后根據(jù)各樣品的拷貝數(shù)濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，其中X0為起始模板量。然后將未知樣本的Cq值與此標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，確定其拷貝數(shù)濃度。

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)模板起始濃度越大時，熒光達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Cq值越小。反之，模板起始濃度越小時，Cq值越大。起始模板量的Log值與循環(huán)數(shù)Cq值呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可確定未知待測樣本中目的基因的量。

如何選擇標(biāo)準(zhǔn)品？

如前所述，生成絕對標(biāo)準(zhǔn)曲線采用的模板將決定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。所以最好使用與實驗樣本盡可能類似的目標(biāo)模板，可優(yōu)選有證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考物質(zhì)。那么制備標(biāo)準(zhǔn)品的常見方法如下：

☑  DNA 標(biāo)準(zhǔn)品：目的靶點的PCR擴增片段或含有目的靶點的質(zhì)�？寺。▓D2）。

優(yōu)點：易于生成、定量，可在適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下維持穩(wěn)定性。

缺點：無法進行qRT-PCR 的逆轉(zhuǎn)錄步驟，大大影響了反應(yīng)效率。

PCR擴增片段：通過常規(guī)PCR進行目的片段擴增，回收純化PCR擴增片段，可直接作為標(biāo)準(zhǔn)品，相對于質(zhì)粒，PCR擴增片段不是那么穩(wěn)定。

質(zhì)�？寺。簩⒛康钠�段進行PCR擴增，回收目的條帶后連入T載體，再進行質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。

☑  RNA 標(biāo)準(zhǔn)品：目的靶點的體外轉(zhuǎn)錄RNA(圖3)

優(yōu)點：結(jié)合了RT效率，最大程度地模擬了目的靶點。

缺點：需要耗費時間生成該標(biāo)準(zhǔn)品，因其不穩(wěn)定，難以保持長期準(zhǔn)確度。

體外轉(zhuǎn)錄RNA：利用實時熒光定量PCR生成的PCR 產(chǎn)物可利用包含5’ T7啟動子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆轉(zhuǎn)錄引物重新擴增。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成多聚腺苷酸化正義mRNA。純化后可將其準(zhǔn)確定量并稀釋，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Azure  Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)——絕對定量示例

1、實驗方法：

•方法:從組織中提取基因組DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

•試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

•標(biāo)準(zhǔn)品:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10⁶、10⁵ 、10⁴ 、 10³ 、10²、10¹；3個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照

•實驗步驟:提取gDNA→設(shè)計特異引物探針→qPCR擴增→結(jié)果分析

2、實驗數(shù)據(jù)：

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線：

R^2=1    y= -3.349x+32.87

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