PCR替代技術(shù)，RPA全攻略之疑難解答
 

      重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)(由英國公司TwistDx Inc開發(fā))。以此為基礎(chǔ)的TwistAmp® 核酸擴增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

RPA反應(yīng)需要在怎樣的溫度下進(jìn)行?

      標(biāo)準(zhǔn)TwistAmp®試劑盒的運行溫度在37°C - 42°C之間。溫度超過42°C會使酶的活性受到影響。RPA反應(yīng)在低于37°C的條件下也能進(jìn)行，不過TwistAmp®試劑盒已經(jīng)針對反應(yīng)速度進(jìn)行了優(yōu)化，不一定支持超出范圍的溫度條件。為了獲得更好的效果，TwistDx公司推薦用戶在40°C下使用于逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。

RPA反應(yīng)能實現(xiàn)多重化么?

       可以。RPA技術(shù)支持在同一個管中同時進(jìn)行多個擴增反應(yīng)。不過，多重化的引物組合需要精心設(shè)計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應(yīng)的引物總量(nmol)最好不要超標(biāo)太多。如果在一個反應(yīng)中使用兩個以上的擴增引物，就應(yīng)該控制不同引物的量。另外，我們應(yīng)當(dāng)事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設(shè)備以及熒光團的兼容性。

RPA反應(yīng)需要在特殊儀器上進(jìn)行么?

      不需要。對TwistAmp®基礎(chǔ)試劑盒和nfo試劑盒而言，只要溫度能控制在37-42°C之間就行。進(jìn)行實時監(jiān)控的體系(如TwistAmp® exo試劑盒)，需要能夠激發(fā)和檢測熒光團的恒溫裝置，比如酶標(biāo)儀或?qū)崟r檢測的熱循環(huán)儀。

RPA反應(yīng)能對模板進(jìn)行定量么?

      可以。擴增子達(dá)到可檢出水平的時間，依賴于反應(yīng)起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達(dá)到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應(yīng)是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進(jìn)行控制。因為鎂離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應(yīng)就會開始。
此外，較慢的擴增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調(diào)整反應(yīng)條件或引物設(shè)計來減慢RPA的反應(yīng)速度。

擴增產(chǎn)物能在瓊脂糖凝膠上分析么?

      可以，TwistAmp®基礎(chǔ)反應(yīng)、TwistAmp®nfo和TwistAmp® fpg都可以通過跑膠進(jìn)行終點分析。不過TwistAmp® exo不行，因為該系統(tǒng)里的外切核酸酶會消化擴增子。

擴增反應(yīng)能進(jìn)行熒光終點分析么?

      可以。這樣比較的是反應(yīng)開始時的熒光和反應(yīng)結(jié)束時的熒光，熒光增強意味著發(fā)生了擴增。

RPA支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸么?

      支持。在RPA反應(yīng)中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現(xiàn)差不多。據(jù)悉還沒有發(fā)現(xiàn)任何差異。

能用插入性染料實時監(jiān)控RPA么?

可以。插入性染料可以在RPA反應(yīng)中進(jìn)行定量和監(jiān)控。不過，這種染料可以結(jié)合任何雙鏈DNA，會生成來自引物的假陽性信號。由于RPA擴增在常溫下進(jìn)行，這種噪音會比PCR嚴(yán)重一些。此外，不推薦把插入性染料用于TwistAmp® exo體系，因為體系中的核酸外切酶會在反應(yīng)過程中切割擴增產(chǎn)物。

RPA試劑能制成master-mix么?

      可以。在進(jìn)行DNA檢測時，可以把重懸緩沖液、引物和探針混合在一起，重懸凍干的RPA pellets。然后將不同DNA加入反應(yīng)體系，最后用MgAc起始反應(yīng)。在進(jìn)行引物篩選時，可以用重懸緩沖液、模板DNA、探針和一個引物制成master-mix，將其分裝到1.5 ml小管之后再分別加入不同的引物。注意：只有當(dāng)兩個引物都存在時，才能重懸凍干的RPA pellets，否則重組過程就會有偏向性。

跑膠之前需要回收RPA產(chǎn)物么?

      需要。RPA反應(yīng)中的物質(zhì)會干擾瓊脂糖電泳，如果不進(jìn)行產(chǎn)物回收，跑出來的帶會出現(xiàn)拖尾。

RPA反應(yīng)的擴增子能保存么?

       TwistAmp® Basic或nfo的擴增產(chǎn)物可以保存，短期可以放在4°C，保存時間較長的話建議放在-20°C。

TwistAmp® exo (RT)的擴增產(chǎn)物不能保存。因為擴增停止后如果沒有及時失活，外切酶III會快速消化擴增子。

TwistAmp® 基礎(chǔ)反應(yīng)的擴增子能進(jìn)行TA克隆么?

      TwistAmp®基礎(chǔ)反應(yīng)中的聚合酶沒有編輯功能，擴增子應(yīng)該是可以用于TA克隆的。不過TwistDx公司還沒有針對這項應(yīng)用進(jìn)行過測試。

能直接用標(biāo)記的探針和TwistAmp®基礎(chǔ)試劑盒進(jìn)行側(cè)流層析檢測么?

      可以。你可以用兩個經(jīng)過修飾的引物來進(jìn)行側(cè)流層析檢測(LFD)。不過TwistDx公司推薦使用探針和TwistAmp® nfo 試劑盒。這是因為RPA跟PCR差不多，也傾向于形成引物二聚體。如果引物不完美，很容易發(fā)生交叉反應(yīng)，生成假陽性結(jié)果。而TwistAmp® nfo體系能夠避免這個問題。

在用側(cè)流層析試紙進(jìn)行檢測時需要稀釋RPA產(chǎn)物么?

      是的。RPA反應(yīng)中的一些物質(zhì)會干擾試紙上的抗體，如果不能充分稀釋就會出現(xiàn)非特異性結(jié)合和假陽性信號。

在TwistAmp® exo (RT)反應(yīng)即將結(jié)束時熒光急劇增強，這正常么?

       是正常的。在TwistAmp® exo反應(yīng)中，聚合酶和核酸外切酶III處于競爭關(guān)系。隨著反應(yīng)的能量逐漸耗盡，核酸外切酶III開始占據(jù)優(yōu)勢，結(jié)果導(dǎo)致熒光信號出現(xiàn)劇增。

原文鏈接：http://www.warbio.cn/news/show-1390.html