Nanolive無標(biāo)記顯微鏡在病毒感染活細(xì)胞的3D病變效應(yīng)觀察的應(yīng)用
瑞士Nanolive公司開發(fā)的Nanolive 3D CX 顯微鏡采用三維全息斷層掃描顯微技術(shù)（DHTM），該技術(shù)發(fā)表于2013年自然光學(xué)期刊【Cotte et al., Nature Photonics7 (2013) 113–17.】。Nanolive 3D CX采集樣本物理學(xué)折射率圖像，實(shí)現(xiàn)定量無標(biāo)記觀察；采用1類激光光源，波長520nm，溫和低功率0.2mW/mm2，相當(dāng)于歐洲中部太陽輻射的五分之一，因而可對(duì)樣本進(jìn)行幾乎無干擾的實(shí)時(shí)連續(xù)觀察，克服了光毒性及光漂白影響的問題。
細(xì)胞病變效應(yīng)（CPEs）是感染發(fā)生時(shí)的一種細(xì)胞學(xué)特征。因?yàn)楣舛拘缘拇嬖冢?dāng)采用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長期連續(xù)的觀察時(shí)，難以客觀評(píng)估細(xì)胞病變效應(yīng)（CPEs）。蘇黎世大學(xué)的格雷博小組通過數(shù)字全息斷層掃描顯微技術(shù)（DHTM），發(fā)現(xiàn)了病毒侵染活細(xì)胞時(shí)的不同模式。全息斷層掃描顯微技術(shù)（DHTM）觀察樣本時(shí)無需標(biāo)記，簡化樣本處理流程；低能束激光通過透明樣本時(shí)記錄相位差，從而使得長期連續(xù)顯微觀察時(shí)光毒性的問題一并解決。該技術(shù)（DHTM）可測量折射率（RI），并計(jì)算折射率梯度（RIG），從而揭示細(xì)胞的光學(xué)異質(zhì)性。通過研究，格博雷小組發(fā)現(xiàn)，痘苗病毒（VACV）、單純皰疹病毒（HSV）和鼻病毒（RV）感染細(xì)胞可漸進(jìn)性的增加折射率梯度（RIG），且三種感染的折射率梯度（RIG）的變化趨勢與程度因病毒而不同。痘苗病毒感染，而非單純皰疹病毒、鼻病毒感染，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞體積的振蕩性收縮與膨脹。三種病毒感染均改變細(xì)胞膜動(dòng)態(tài)，導(dǎo)致的凋亡特征類似于星形孢菌素的效果。作者指出，全息斷層掃描顯微技術(shù)（DHTM）作為定量無標(biāo)記顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞感染研究，在最小擾動(dòng)的條件下揭示了具有病毒特異性的變化與細(xì)胞病變效應(yīng)。
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折射率梯度(RIG)計(jì)算
折射率梯度(RIG)描述了三維立體空間中特定立體像素與相鄰單元之間折射率(RI)的改變，如上圖所示，中心深藍(lán)色立體像素的折射率梯度(RIG)基于各維度相鄰淺藍(lán)色立體像素的折射率(RI)測算，計(jì)算公式如下：
折射率梯度(RIG)由Nanolive 3D CX 系統(tǒng)配套軟件STEVE計(jì)算分析。
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細(xì)胞體積測量：
細(xì)胞體積測量由軟件STEVE及Imaris完成。如上圖A所示，為了衡量基于DHTM的體積測量的準(zhǔn)確性，研究小組采用0.5um、0.75um、2um、4um的聚苯乙烯珠球進(jìn)行了評(píng)估。聚苯乙烯珠球成像后的體積測算，采用兩種不同的分析方法，Nanolive 3D CX 系統(tǒng)配套軟件STEVE，是以像素為基礎(chǔ)的方法；第三方三維圖像分析軟件Imaris，基于對(duì)象的的三維切面分割方法。如上圖B所示，兩種方法分析結(jié)果接近，Imaris分析更準(zhǔn)確一點(diǎn).
Nanolive 3D CX 連續(xù)觀察動(dòng)態(tài)視頻
1，細(xì)胞形態(tài)與體積動(dòng)態(tài)觀察（灰階圖像）
無侵染發(fā)生HELA細(xì)胞，在長達(dá)8小時(shí)的連續(xù)觀察中，細(xì)胞體積恒定。
而痘苗病毒（VACV）侵染的HELA細(xì)胞，細(xì)胞體積經(jīng)歷了振蕩性的收縮與膨脹。鏈接視頻1：痘苗病毒（VACV）侵染HELA細(xì)胞體積變化。
視頻鏈接：https://v.youku.com/v_show/id_XNDYyMTg4OTgwOA==.html
2，藥物處理抑制鼻病毒誘導(dǎo)的折射率增加（數(shù)字染色圖像）。其中，細(xì)胞膜綠色標(biāo)記，高折射率與高折射率梯度區(qū)域紅色標(biāo)記。
相對(duì)于無侵染HELA細(xì)胞，鼻病毒（RV）侵染HELA細(xì)胞為代表的折射率梯度（RIG）顯著增加了2.5倍（視頻鏈接2）；當(dāng)研究小組使用抑制劑MLN9708(10uM)處理鼻病毒感染細(xì)胞時(shí)，可以明顯挽救折射率梯度（RIG）增加的表型（視頻鏈接3）。
視頻鏈接2：鼻病毒（RV）侵染HELA細(xì)胞折射率梯度（RIG）變化
視頻鏈接：https://v.youku.com/v_show/id_XNDYyMTg5MDI2OA==.html
視頻鏈接3：鼻病毒（RV）侵染HELA細(xì)胞，MLN9708（10uM）處理后細(xì)胞折射率梯度（RIG）變化https://v.youku.com/v_show/id_XNDYyMTg5MDU2MA==.html
