CRISPR/Cas9已經(jīng)成為最常用的基因編輯系統(tǒng)。CRISPR/Cas9包括2部分：Cas9核酸內(nèi)切酶和sgRNA(single guide RNA)，sgRNA由天然的tracrRNA (transactivating crRNA)和crRNA (CRISPR RNA)融合而來。

使用CRISPR/Cas9工具進(jìn)行基因敲除等基因編輯時(shí)，首先要進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)。理論上只要根據(jù)PAM序列(SpCas9識(shí)別的最佳PAM是5-NGG-3)對(duì)所需靶向的物種基因組進(jìn)行掃描，即可設(shè)計(jì)所有可能的sgRNA。但如何設(shè)計(jì)合理有效的sgRNA則需要謹(jǐn)慎考慮，因?yàn)檫@將決定其基因編輯結(jié)果。

 

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)^[2]
 

隨著近年來研究的不斷深入，研究者對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)機(jī)制已有非常全面的了解。這些研究結(jié)果也促進(jìn)了大量的sgRNA設(shè)計(jì)工具的出現(xiàn)^[1,3]，從而給研究者提供了快速、高效的sgRNA設(shè)計(jì)選擇。

sgRNA的5’包括20nt的protospacer序列，該序列和靶向DNA序列互補(bǔ)以實(shí)現(xiàn)雙鏈切割；其3’則為固定的一段具有莖環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)的支架序列(scaffold sequence)，該序列和Cas9蛋白帶正電的凹槽相互作用形成核糖核蛋白復(fù)合物(ribonucleoprotein complex, RNP)。一般sgRNA序列大多指20nt的protospacer序列。

大部分的sgRNA設(shè)計(jì)工具，除展示設(shè)計(jì)序列外，主要包括效率和特異性評(píng)價(jià)，并給出參考評(píng)價(jià)分值。而不同工具所基于的數(shù)據(jù)和算法，導(dǎo)致給出特異性和效率結(jié)果可能不同。由于sgRNA特異性主要取決于是否存在潛在的錯(cuò)配序列，不同工具間結(jié)果一致性往往較高；但是對(duì)于效率預(yù)測，目前并沒有非常成熟的預(yù)測工具，研究者使用時(shí)需要謹(jǐn)慎參考。

 

在工具設(shè)計(jì)頁面上，不同的工具偏重點(diǎn)不同。很多工具提供不同的物種基因組序列，可使用基因ID直接獲得sgRNA；或者通過輸入候選序列進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)。并且大都能提供多種CRISPR/Cas系統(tǒng)以供設(shè)計(jì)。

下面簡單介紹幾種sgRNA設(shè)計(jì)工具：

Broad Institute GPP

(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)

較早出現(xiàn)的sgRNA在線設(shè)計(jì)工具，主要基于Doench等人2篇非常全面深入的sgRNA設(shè)計(jì)優(yōu)化研究^[4,5]，以提供最高效率和最小脫靶可能的sgRNA設(shè)計(jì)。

該工具可應(yīng)用于CRISPRko，CRISPRa(CRISPR activation)和CRISPRi(CRISPR interference)的sgRNA設(shè)計(jì)。提供包括SpCas9、SaCas9、AsCas9和enAsCas9四種CRISPR工具，以及human、mouse和rat三種物種基因組設(shè)計(jì)選擇。該工具可以通過序列直接輸入、基因ID和序列文件導(dǎo)入進(jìn)行設(shè)計(jì)。大部分在線工具同時(shí)能提供在線展示和下載。但該工具設(shè)計(jì)結(jié)果需要下載，不提供在線的結(jié)果展示。

crispr.mit.edu(R.I.P)

   

曾經(jīng)最為廣泛使用的sgRNA設(shè)計(jì)工具(已于2017關(guān)閉)。提供WT和nickases兩種Cas9的sgRNA設(shè)計(jì)。其優(yōu)點(diǎn)是通過算法預(yù)測，對(duì)設(shè)計(jì)的sgRNA給出高、中、低三個(gè)可用等級(jí)便于使用者快速選擇。其頁面設(shè)計(jì)能快速瀏覽sgRNA的潛在脫靶位點(diǎn)，非常受研究者喜愛。

一個(gè)致命問題是該工具過濾了重復(fù)序列區(qū)域(repeat region)，這樣如果你的sgRNA序列在基因組上存在多個(gè)重復(fù)，該工具并不能提醒。

 

Deskgen

(https:///landing/#/)

隨著CRISPR/Cas9的服務(wù)提供商的興起，一些企業(yè)推出的sgRNA設(shè)計(jì)工具也非常具備使用性，并且這些工具往往貼合基因編輯設(shè)計(jì)，提供體驗(yàn)良好的可視化頁面(比如：synthego,IDT, deskgen)。

其中DESKGEN AI是通過人工智能算法的設(shè)計(jì)工具，屬于較為主流的CRISPR基因組編輯設(shè)計(jì)商業(yè)工具。

  

CRISPR finder

(https://www.sanger.ac.uk/htgt/wge/find_crisprs)

最大的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)是可通過ensembl數(shù)據(jù)庫的基因頁面上顯示sgRNA位置，提供基因組標(biāo)注sgRNA瀏覽。便于快速的選定基因組的sgRNA序列。使用filter可快速選擇不同等級(jí)的sgRNA顯示。

  

crisprgold

 (https://crisprgold.mdc-berlin.de/index.php)

該工具獨(dú)特的提出一個(gè)關(guān)于sgRNA活性的見解^[9,10]，如果protospacer和scaffold序列存在一定的互補(bǔ)，則會(huì)產(chǎn)生binding energy，則可能影響正常的sgRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響對(duì)靶序列的識(shí)別和結(jié)合，該工具將這一因素考慮在內(nèi)，進(jìn)而可以提供活性更高的sgRNA設(shè)計(jì)。。 

 

DeepHF

 (http://www.deephf.com/index/#/Predict)

通過測試人全基因組8萬多個(gè)sgRNA的細(xì)胞系水平活性效率^[6]，在此數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上利用深度學(xué)習(xí)的方法建立了sgRNA效率的預(yù)測模型。與已有的模型相比，具有更準(zhǔn)確的預(yù)測效果。

但值得注意的是，該模型數(shù)據(jù)來源于人的細(xì)胞系，可能并不適用于如小鼠或其他物種預(yù)測。

inDelphi和 FORECasT

(https://indelphi.giffordlab.mit.edu/)

(https://partslab.sanger.ac.uk/FORECasT#results)

 

以往認(rèn)為，CRISPR/Cas9在無模板的情況下，通過NHEJ產(chǎn)生的修復(fù)結(jié)果是隨機(jī)的indel。但近年多篇研究發(fā)現(xiàn)，同一靶點(diǎn)的sgRNA序列存在比較一致的修復(fù)結(jié)果(indel)，更進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)，一部分的sgRNA的修復(fù)結(jié)果(the outcome of CRISPR-mediated editing)是可以預(yù)測的^[7,8]。inDelphi和FORECasT是最近出現(xiàn)的sgRNA無模板編輯預(yù)測工具，這對(duì)研究者準(zhǔn)確設(shè)計(jì)和使用sgRNA，以得到預(yù)期基因編輯目的提供的進(jìn)一步幫助。

當(dāng)前眾多的sgRNA設(shè)計(jì)工具幾乎都是通過大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集和系統(tǒng)分析，建立相應(yīng)的模型或算法。隨著更多CRISPR / Cas9數(shù)據(jù)集的出現(xiàn)，以及結(jié)合人工智能和深度學(xué)習(xí)算法，后續(xù)有望出現(xiàn)更多大數(shù)據(jù)集合、算法優(yōu)化的設(shè)計(jì)工具。

參考文獻(xiàn)

[1]Cui,Yingbo, et al. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA Design Tools.Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences 10.2 (2018): 455-465.

[2]Graham, Daniel B., and David E. Root. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology 16.1 (2015): 260-260.

[3]Lee, Ciaran M., Timothy H. Davis, and Gang Bao. Examination of CRISPR/Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity. Experimental Physiology 103.4 (2017): 456-460.

[4]Doench, John G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology 34.2 (2016): 184-191.

[5]Sanson, Kendall R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications 9.1 (2018).

[6]Wang, Daqi, et al. Optimized CRISPR guide RNA design for two high-fidelity Cas9 variants by deep learning. Nature Communications 10.1 (2019): 1-14.

[7]Shen, Max W., et al. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants.. Nature 563.7733 (2018): 646-651.

[8]Chakrabarti, Anob M., et al. Target-Specific Precision of CRISPR-Mediated Genome Editing. Molecular Cell 73.4 (2019).

[9]Chu, Van Trung, et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 113.44 (2016): 12514-12519.

[10]Graf, Robin, et al. sgRNA Sequence Motifs Blocking Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Cell Reports 26.5 (2019).
 

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