李斯特氏菌的檢驗(yàn)方法！
 
李斯特菌（也稱李氏桿菌）引起的急性傳染病，以敗血病為主要癥狀，伴有內(nèi)臟器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。李斯特菌是1926年英國南非裔科學(xué)家穆里在病死的兔子體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的，為紀(jì)念近代消毒手術(shù)之父、英國生理學(xué)家約瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三屆國際微生物學(xué)大會(huì)命名為李斯特菌。
單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。
李斯特菌在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染，很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的李斯特菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。
其中單增李斯特菌是唯一能引起人類疾病的。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 增菌培養(yǎng)
將未開封的測試片貯藏在≤8℃的環(huán)境下，并在包裝上標(biāo)示的有效期內(nèi)使用。在高濕度的地方，最好在使用前將測試片回復(fù)到室溫。
取回的樣品應(yīng)在4℃下處理、存放和運(yùn)送，如果是冷凍樣品，則在檢驗(yàn)前要保持冷凍狀態(tài)。
取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質(zhì)杯中進(jìn)行均質(zhì)，然后轉(zhuǎn)入三角瓶中，30℃培養(yǎng)4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮，繼續(xù)培養(yǎng)20h和44h.。
2. 分離
共培養(yǎng)24h和48h后，取EB培養(yǎng)物分別在OXA和LPM或加七葉苷/Fe3 LPM瓊脂平板上劃線。PALCAM瓊脂可替代LPM瓊脂。將OXA和PALCAM平板置于35℃培養(yǎng)24-48h，LPM平板在30℃培養(yǎng)24-48h。然后，把LPM平板放于解剖鏡載物臺(tái)上，以450角入射光從平板下面照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽性菌和陰性菌劃線的平板作對照。
已開封的測試片，將開口反折，用膠帶封好。
加入七葉苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系統(tǒng)，選擇可疑菌落的方法與在OXA上選擇可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周圍有一個(gè)黑色環(huán)，其它菌也可形成黑色環(huán)，但形成時(shí)間要在兩天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。
在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5個(gè)或更多的典型菌落，分別劃線于TSAYE平板上以得到更純、更典型的單個(gè)菌落。食品檢驗(yàn)中在TSAYE平板上純化是必須的，因?yàn)樵赑ALCAM和OXA或LPM平板上分離菌落時(shí)可能沾有不可見的受抑微生物。挑取5個(gè)典型菌落的原因是一個(gè)樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培養(yǎng)24-48h，如果不用于動(dòng)力觀察，也可在35℃培養(yǎng)。
3. 鑒定步驟
為防止暴露于潮濕的環(huán)境中，請不要冷藏已開封的測試片。將膠帶封好的測試片貯藏在低溫干燥的地方，保持時(shí)間不超過1個(gè)月。請勿將測試片放在溫度> 25℃和(或)相對濕度>50%的環(huán)境中。
1）觀察TSAYE平板通過斜射光觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對照。
2）從30℃或更低溫度下培養(yǎng)的TSAYE平板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。如果菌量太少，菌體黏附于載玻片上而呈現(xiàn)非運(yùn)動(dòng)性。李斯特氏菌是細(xì)短桿菌，可見輕微的旋轉(zhuǎn)及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對照相比，球形、大的桿狀且快速泳動(dòng)的都不是李斯特氏菌。
3）挑取典型菌落進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽性反應(yīng)。
4）取16-24h的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽性桿菌。但是陳舊培養(yǎng)物革蘭氏染色會(huì)發(fā)生變化，而且菌體可成球形。在染色過重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢，易誤認(rèn)為白喉菌而錯(cuò)判。
4. 用涂抹棒、海棉或其它采樣設(shè)備收集環(huán)境樣本。濕潤采樣設(shè)備的液體應(yīng)≤10 mL。濕潤劑可以是無菌水、緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和緩沖液，如Letheen肉湯或Dey/Engley (DE)中和肉湯。
5）挑取典型菌落接種于TSBYE肉湯管中，35℃培養(yǎng)24h用做糖類發(fā)酵和其它生化項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)。TSBYE肉湯管在4℃下可存放幾天，也可反復(fù)接種。
6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺種到5%的綿羊血或馬血瓊脂平板上，刺種時(shí)避免觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時(shí)設(shè)陽性對照（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對照（英諾克李斯特氏菌），35℃培養(yǎng)48h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血環(huán)。
7）在明亮的光照下，觀察經(jīng)穿刺的血瓊脂平板，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點(diǎn)產(chǎn)生較清晰的β-溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，而綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生界限明顯的較大溶血環(huán)，在此不要試圖進(jìn)行種間的區(qū)分，但要記錄下溶血反應(yīng)的特征，CAMP試驗(yàn)可區(qū)分它們間的溶血反應(yīng)。
8）硝酸鹽還原試驗(yàn)（選做）。用TSBYE肉湯培養(yǎng)物接種于硝酸鹽肉湯中，35℃培養(yǎng)5天后，加入0.2mL試劑A，再加入0.2mL試劑B，混合，出現(xiàn)紫紅色為陽性反應(yīng)，表明硝酸鹽已被還原，如無顏色出現(xiàn)，在試管內(nèi)再加入少量鋅粉，放置1h，如出現(xiàn)紫紅色，表明硝酸鹽仍存在，未被細(xì)菌還原。只有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽，因此，從格氏李斯特氏菌中區(qū)分出默氏李斯特氏菌就必須進(jìn)行這唯一的試驗(yàn)。本試驗(yàn)還有一等效試驗(yàn)，即加入0.2mL試劑A后，再加入0.2mL試劑C，出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽已被還原。如未出現(xiàn)顏色反應(yīng)，也加入少量鋅粉，若出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽未被還原。
5. 在無菌環(huán)境下在收集的樣品中添加5 mL，20-30℃，滅過菌的緩沖蛋白胨水(BPW)溶液。不要將Petrifilm EL測試片與Vermont 培養(yǎng)基(UVM)、Fraser肉湯、李斯特菌增菌培養(yǎng)基 (LEB)或緩沖李斯特菌增菌培養(yǎng)基(BLEB)共用。
9）將TSBYE培養(yǎng)物穿刺到SIM和MTM試管中，室溫培養(yǎng)7天，每日觀察，李斯特氏菌呈典型傘狀生長。在MTM中傘狀生長更典型。同時(shí)，30℃的TSBYE培養(yǎng)物在油鏡下可見細(xì)菌作翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。
10）將TSAYE肉湯培養(yǎng)物分別接種于0.5%（W/V）葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發(fā)酵管內(nèi)（可選用倒立發(fā)酵管），35℃培養(yǎng)7天，呈陽性反應(yīng)的李斯特氏菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，李斯特氏菌發(fā)酵鼠李糖和木糖的情況見下表。所有李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖均能發(fā)酵，除格氏李斯特氏菌均不能發(fā)酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七葉苷/Fe3 的LPM分離平板上菌落色素很明顯，則七葉苷試驗(yàn)可免做。
6. 混合，蠕動(dòng)或旋轉(zhuǎn)樣品與BPW的混合液將近一分鐘。將樣品置于室溫(20-30℃) 1h，最久不超過1.5 h，以修復(fù)損傷的李斯特菌。
將TSBYE肉湯培養(yǎng)物接種到3mLTSBYE肉湯中，35℃培養(yǎng)24h，接種2支TSAYE瓊脂斜面，35℃培養(yǎng)24h。用3mL0.01mol/l磷酸鹽緩沖液將斜面菌苔洗下，菌懸液于80℃水浴中加熱1h，以2500r/min離心30，棄去2mL上清夜，將剩余液與沉淀混勻制成菌懸液，進(jìn)行血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)。
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