江湖寒，刀鋒冷，人斷腸。問(wèn)世間江湖，幾許清醒，幾許夢(mèng)寒？狂歌以后，路遙遙，風(fēng)沙厲!                                    

——古龍

時(shí)光荏苒，歲月穿梭，現(xiàn)已是公元2019年，回望2018，請(qǐng)?jiān)试S小編以這古龍先生之詞懷金庸先生之作。2018，注定是不平凡的一年，生命科學(xué)領(lǐng)域可謂是悲喜交加，前有科學(xué)家利用單細(xì)胞分離與單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)揭示胚胎發(fā)育過(guò)程助力生命醫(yī)學(xué)研究，后有飽受爭(zhēng)議的世界首例基因編輯嬰兒的誕生^[1]，科學(xué)的腳步以超乎人類(lèi)想象的速度，始終如一的前進(jìn)著。 在新的一年里，小編由衷的祝福各位小伙伴能夠早日實(shí)現(xiàn)自己的人生目標(biāo)，勇往直前，無(wú)問(wèn)西東！

好了，言歸正傳，今天小編要給大家科普一項(xiàng)跨越百年的神技能-顯微注射。話(huà)不多說(shuō)，先來(lái)一組圖給大家提提神兒(圖1)：

圖1.顯微注射發(fā)展史^[2]

哈，小伙伴們是不是有點(diǎn)小驚訝? 顯微注射都這么大歲數(shù)了！沒(méi)錯(cuò)，正如大家看到的，從1904年第一臺(tái)微注射裝置問(wèn)世以來(lái)，歷經(jīng)體外對(duì)小鼠受精卵、囊胚、前核的顯微注射，再到后續(xù)的基因敲除小鼠以及靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物克隆的誕生，距今已走過(guò)一個(gè)多世紀(jì)了。顯微注射及其微操縱技術(shù)在醫(yī)學(xué)概念與技術(shù)突破方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。截止到目前，至少有5項(xiàng)與顯微注射密切相關(guān)的突破獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，詳見(jiàn)圖2。^[2]

圖2. 諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者^[2]

說(shuō)到這，想必小伙伴們已經(jīng)知道了顯微注射技術(shù)的發(fā)展歷程以及它的存在對(duì)科學(xué)研究的重大影響，下面隨小編進(jìn)一步了解下顯微注射技術(shù)吧！^[2]

顯微注射技術(shù)概念及原理

顯微注射法（Microinjection）簡(jiǎn)單來(lái)講就是利用管尖極細(xì)的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)，用以研究供體物的功能或者獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)。^[2-4]

顯微操作系統(tǒng)工作站

顯微注射說(shuō)著是挺簡(jiǎn)單，實(shí)際上對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求那是相當(dāng)?shù)母�，必須配備一組高精密的顯微操作系統(tǒng)才可以完成任務(wù)。既然是說(shuō)顯微注射嘛，那一定要在顯微鏡下操作的，所以首先需要配備一臺(tái)倒置顯微鏡（圖3A），還需要一款Leica（圖3a）或者Eppendorf（圖3b）制造的微操作器（圖3B）用以連接Narishige顯微注射器（圖3C），當(dāng)然這些精密設(shè)備一定要放置在減震臺(tái)（圖3D）上，這樣才能在一定程度上避免震動(dòng)因素給顯微操作過(guò)程帶來(lái)的不利影響。^[2]

圖3.顯微操作系統(tǒng)工作站^[2]

顯微操作時(shí)需要在顯微注射室中進(jìn)行,首先向60×15mm培養(yǎng)皿（圖4A）中加入一滴礦物油包裹的CZB/H培養(yǎng)基（圖4B）,再將宿主細(xì)胞放入液滴中, 眼睛一定要緊盯著顯微鏡頭哦，接下來(lái)就要進(jìn)行“左右互搏術(shù)”啦，咱先擺好pose，左手持吸管（圖4C）固定細(xì)胞,右手持配有不同規(guī)格外徑的注射針（圖4D）,然后開(kāi)始注射外源物^[2]，結(jié)果會(huì)像是圖5這樣，將人類(lèi)精子注入卵子包漿中，雖然這個(gè)過(guò)程需要“一心二用”，小編相信只要反復(fù)練習(xí)，假以時(shí)日,小伙伴們一定會(huì)做的非常好滴~

圖4.顯微注射室^[2]

顯微注射技術(shù)應(yīng)用

1、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（ICSI）

概念及應(yīng)用

既然說(shuō)到這個(gè)卵子胞漿內(nèi)精子注射，小編這里搜羅了一段關(guān)于他的小故事給大家講講。話(huà)說(shuō)自上個(gè)世紀(jì)90年代初期，卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（ICSI），即第二代“試管嬰兒”的出現(xiàn)真是轟動(dòng)世界一時(shí)啊，該技術(shù)主要是在顯微鏡下將單一精子注射到卵子內(nèi)以達(dá)到人工受精的效果，這種“包辦婚姻”式的過(guò)程可以說(shuō)為生殖缺陷的患者帶來(lái)了巨大福音（圖5）。隨后此技術(shù)開(kāi)始擴(kuò)展到其他物種身上，包括牛、羊、馬、兔、豬、小鼠等。^[2,6]

圖5. 人類(lèi)卵子胞漿內(nèi)精子注射圖^[3]

ICSI應(yīng)用的局限性

雖然ICSI在早期可以提高受精成功率，增加轉(zhuǎn)基因效率。但科學(xué)家們經(jīng)大量實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，目前該技術(shù)僅在馬上應(yīng)用率較高，在應(yīng)用其他一些模式動(dòng)物制備上或多或少都存在一定的局限性，比如奶牛經(jīng)ICSI后，受精率就特別低^[2,6]，而小鼠經(jīng)ICSI后，出現(xiàn)后期胚胎發(fā)育遲緩的問(wèn)題^[2,8]。此外，正常受精是需要經(jīng)歷精子獲能、頂替反應(yīng)以及精子穿過(guò)卵子外的放射冠和透明帶等一系列過(guò)程的。而ICSI技術(shù)的建立是逾越了精子進(jìn)入卵子的一系列程序，也就失去了卵子對(duì)精子的自然選擇過(guò)程，對(duì)物種進(jìn)化存在著某種潛在威脅性，再加上ICSI操作本身的非自然性，對(duì)于顯微注射要求較高，在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物特別是模式型小鼠上可能發(fā)生制備異常的情況出現(xiàn)^[7]。相比近幾年興起的可跨越種間障礙進(jìn)行基因編輯的CRISPR/Cas9技術(shù)遜色一點(diǎn)兒哈，有待繼續(xù)升級(jí)哦!

2、胚胎干細(xì)胞（ESC）囊胚顯微注射

目前，胚胎干細(xì)胞囊胚顯微注射技術(shù)已趨于成熟，其主要在體外將外源基因?qū)�入�?jīng)培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞中，然后將轉(zhuǎn)基因的胚胎干細(xì)胞通過(guò)顯微操作儀注入動(dòng)物囊胚(圖6：②)，此胚胎干細(xì)胞可參與宿主的胚胎構(gòu)成，形成嵌合體(圖6：②-③)，得到種系嵌合F0代小鼠(圖6：④-⑤)，再與對(duì)應(yīng)品系背景的小鼠進(jìn)行雜交,直到獲得我們所需要的純合子小鼠(圖6：⑥)。^[9]

圖6. 基于同源重組的ESC克隆產(chǎn)生基因組修飾小鼠^[9]

3、CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因改造小鼠

雖然顯微注射是一項(xiàng)非常古老的技術(shù)，但隨著基因組工程技術(shù)的突破性進(jìn)展，特別是近年來(lái)CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，基本消除了精確基因組修飾的物種屏障，顯微注射的應(yīng)用也有了長(zhǎng)足的發(fā)展。CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因改造小鼠的主要流程，如圖7所示，收集小鼠受精卵(圖7：①)，將攜帶目的片段的sgRNA和Cas9 mRNA通過(guò)顯微注射直接注入受精卵內(nèi)(圖7：②)，培養(yǎng)過(guò)夜后轉(zhuǎn)入代孕小鼠的輸卵管中(圖7：③-④)，隨后出生的子代即可獲得目的基因改造小鼠。^[2] 如此的神操作下,明顯降低了基因改造小鼠的制備周期，速度大大地加快了有沒(méi)有！

圖7. CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因改造小鼠流程^[2]

科技前沿

當(dāng)然，隨著科技的進(jìn)步，也有科學(xué)家正在開(kāi)發(fā)一種基于電脈沖CRISPR-EZ的工具，據(jù)說(shuō)一個(gè)具有基本胚胎操作技能的研究生水平的研究者可以在6周內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因小鼠^[10]，不過(guò)目前并未進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化。此外，還有利用體細(xì)胞核移植（SCNT）技術(shù)進(jìn)行克隆猴制備的，目前該技術(shù)領(lǐng)域尚未落地，還有許多問(wèn)題需要解決^[11]。

總結(jié)

21世紀(jì)是人工智能爆發(fā)元年，同樣也是生命大健康綻放的時(shí)代，高通量納米操作器的出現(xiàn)可能會(huì)進(jìn)一步推動(dòng)顯微注射的持續(xù)發(fā)展^[2]，小編相信顯微注射技術(shù)在未來(lái)無(wú)疑會(huì)繼續(xù)找到其獨(dú)特的位置。

好了，今天小編就為大家科普到這。百奧賽圖目前擁有自主開(kāi)發(fā)的基于C57BL/6小鼠胚胎干細(xì)胞的基因編輯系統(tǒng)以及基于CRISPR/Cas9技術(shù)自主研發(fā)的EGE系統(tǒng)（同源重組率提高20倍），可對(duì)多種細(xì)胞系、大小鼠進(jìn)行基因改造，周期短，制備效率高，歡迎感興趣的小伙伴前來(lái)垂詢(xún)！

參考文獻(xiàn)

[1]http://www.seqchina.cn/8761.html

[2]Liu, Chengyu (EDT)/ Du, Yubin (EDT). Microinjection : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Humana Pr Inc.2018

[3]https://en.wikipedia.org/wiki/Microinjection

[4]http://protocol.everlab.net/Protocol/ProtocolBrowse/ProtocolBrowse/c86a2c9e-e69b-411e-95e0-204bba7f8655

[5]https://en.wikipedia.org/wiki/Intracytoplasmic_sperm_injection

[6]Salamone DF, Canel NG, Rodríguez MB. Intracytoplasmic sperm injection in domestic and wild mammals.Reproduction. 2017 Dec;154(6):F111-F124. doi: 10.1530/REP-17-0357. Epub 2017 Dec 1.

[7]http://www.docin.com/p-1032486023.html

[8]唐娜，王曉紅，梁新新。ICSI導(dǎo)致小鼠胚胎雄原核H3K9甲基化異常以及胚胎發(fā)育遲緩 [J]。中華男科學(xué)雜志。2013, 19(7)

[9]Hicham Bouabe and Klaus Okkenhaug.Gene Targeting in Mice: a Review. Methods Mol Biol. Author manuscript; available in PMC 2015 Aug 5.

[10] Andrew J. Modzelewski, Sean Chen, et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR -EZ technology. Nature Protocols. 2018 Jun; 13(6): 1253–1274.

[11]http://www.sohu.com/a/218741408_354973

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