【干貨】 活體成像-讓腫瘤細胞無處遁形
圖1.活體成像[1]
早在1999年由美國哈佛大學Weissleder博士（圖2）率先提出了分子影像學(molecular imaging，MI)的概念，即應用影像學的方法對活體狀態(tài)下的生物過程進行細胞和分子水平的定性和定量研究。活體成像便是基于分子影像學孕育而生的，通過這個成像系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內腫瘤的生長及轉移，感染性疾病的發(fā)展進程，特定基因的表達等生物學過程。
圖2. Ralph Weissleder[2]
近年來，我國醫(yī)療健康產業(yè)發(fā)展突飛猛進，新藥研發(fā)逐漸成為科研機構和醫(yī)藥公司重點研究領域，其中活體成像為藥物研發(fā)貢獻了一份十分寶貴的力量。目前，小動物活體成像技術應用到藥物研發(fā)的實驗方法主要有生物發(fā)光和熒光兩種。
基于生物發(fā)光的活體成像技術方法與應用
生物發(fā)光主要是應用熒光素酶（Luciferase）對基因、細胞和活體動物進行標記。標記細胞的方法基本上是通過分子生物學克隆技術，將熒光素酶的基因插入到預期觀察的細胞染色體內，通過對克隆細胞進行篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株。再將細胞株轉移至特定的小鼠體內形成模型。向模式小鼠注射一次熒光素（熒光素酶的底物）能保持其體內熒光素酶標記的細胞發(fā)光持續(xù)30-45分鐘。因為每次熒光素酶催化反應只能產生一個光子，這是肉眼無法觀察到的，因此需要先進的成像系統(tǒng)，再應用一個高度靈敏的制冷CCD相機以及特別設計的成像暗箱和成像軟件，才可觀測并記錄到這些光子（圖3）。[1,3,4]
簡單來說，熒光素酶與底物反應后，會產生化學發(fā)光。這種光是由化學反應而來，不需要激發(fā)光。儀器記錄的是單位時間內檢測到的光子數(shù)，也就相當于直接定量的記錄了表達熒光素酶的細胞數(shù)量。
圖3. 應用制冷CCD相機捕捉光源
圖4.小鼠靜脈注射Luciferase標記多發(fā)性骨髓瘤的活體成像圖[5]
基于熒光的活體成像技術方法與應用
與生物發(fā)光不同，熒光技術是采用熒光報告基因 (GFP、RFP等) 或熒光染料（包括熒光量子點等新型納米標記材料）進行標記，利用報告基因、熒光蛋白質或染料產生的熒光，就可以形成體內的生物光源。生物發(fā)光是動物體內的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源，而熒光則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)，才可以被成像系統(tǒng)檢測到。熒光標記很廣泛，可以是動物、細胞、微生物，也可以是抗體、藥物、納米材料等[1,3,4]。
接下來小編帶大家再看一組應用熒光技術的實驗：為研究模式蛋白的腫瘤靶向性，將一種近紅外熒光分子吲哚菁綠（ICG）包載PDPA（人血清白蛋白表面定點原位生長出具有pH響應性的高分子鏈）制成納米熒光探針（HDI），ICG包載在膠束核內而發(fā)生熒光聚集淬滅，但到達腫瘤時，由于腫瘤微環(huán)境的弱酸性，膠束解體，ICG釋放出來而恢復熒光，同時由于PDPA質子化帶正電，有利于其吸附在細胞表面以及細胞內吞，從而實現(xiàn)腫瘤靶向熒光成像。本項研究也表明，在蛋白表面引入pH響應性高分子鏈可提高蛋白靶向性，藥用蛋白可采用此項技術提高藥效且降低副作用，同時該響應性蛋白質-高分子偶聯(lián)物自組裝體系也可作為小分子藥物載體，從而拓展了蛋白藥物和小分子藥物的臨床應用[6]。（圖5）
圖5. 小鼠靜脈注射HDI納米熒光探針后C8161黑色素瘤在體內和體外熒光成像圖[6]
雖然熒光信號遠遠強于生物發(fā)光，但非特異性熒光產生的背景噪音使其信噪比遠遠低于生物發(fā)光。兩者具體優(yōu)缺點詳見表（一），對于不同的研究，可根據(jù)二者的特點以及實驗需求，選擇合適的方法哦[7]。
表（一）
圖6. FMI檢測荷4T1-Luc乳腺腫瘤小鼠的PD-1-IRDye800CW生物分布[8]
重點來啦，百奧賽圖目前擁有自主開發(fā)的B-IL17-EGFP敲入小鼠，該小鼠模型所有表達IL17的組織細胞同時表達綠色熒光蛋白(EGFP)，用以研究與細胞因子IL-17相關的一系列慢性疾病[9]。藥理藥效平臺擁有多種GFP-Luciferase細胞系及腫瘤模型，可以進行皮下及原位腫瘤模型建立或轉移瘤模型建立，開展針對相應模型的體內藥理藥效服務[10]�；蚓庉嬈脚_可根據(jù)客戶需求提供多種報告基因（如EGFP、mRFP、mCherry、mYFP或LacZ等）小鼠(目的基因的位置引入報告基因)，方便研究目的基因啟動子的轉錄活性，監(jiān)控目的蛋白表達定位及細胞運轉等[11]。如有需要，歡迎小伙伴們詳細咨詢哦！
[4]李冬梅，萬春麗，李繼承。小動物活體成像技術研究進展.中國生物醫(yī)學工程學報。2009
[5] Delmore JE,et al. BET bromodomain inhibition as a therapeutic strategy to target c-Myc. Cell. 2011 Sep 16;146(6):904-17.
[6]LiP, SunM, XuZ, LiuX, ZhaoW, GaoW.Site-Selective in Situ Growth-Induced Self-Assembly of Protein-Polymer Conjugates into pH-Responsive Micelles for TumorMicroenvironment Triggered Fluorescence Imaging. Biomacromolecules. 2018 Nov 12;19(11):4472-4479.
[7]https://baike.baidu.com/item/可見光活體成像技術
[8]Yang Du,et al. Improved resection and prolonged overall survival with PD-1-IRDye800CW fluorescence probe-guided surgery and PD-1 adjuvant immunotherapy in 4T1 mouse model.Int J Nanomedicine. 2017; 12: 8337–8351.
[9]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/103.html
[10]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/13.html
[11]http://www.bbctg.com.cn/index/index/geneinfo/id/46/cateid/65/cid/12.html
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