ATCC菌種 幽門螺桿菌（Hp）是1983年由Marshall和Warren首次分離得到的一種革蘭染色陰性的、螺旋狀、微需氧、主要定居在人胃黏膜、引起人類消化道疾病發(fā)生發(fā)展的重要病原菌。幽門螺桿菌的感染呈全球性分布，其感染率與當(dāng)?shù)毓�共衛(wèi)生狀況有關(guān)，據(jù)報(bào)道，在西方國家大約30%～50%的成人感染Hp；在中國，其感染率更高，達(dá)50%～80%，并有報(bào)道指出人群中感染Hp的比例隨年齡增長而提高，而且Hp一旦在人胃內(nèi)定居，如不采取抗菌治療，可以持續(xù)幾十年,嚴(yán)重危害著人群健康。盡管大多數(shù)Hp感染者無癥狀，但有近似10％的感染者患上了胃十二指腸潰瘍，胃癌或黏膜相關(guān)組織（MALT）淋巴瘤。1994年Hp被WHO定為第I類致癌因子，而其分泌的蛋白毒素VacA作為單一毒力因子可引起靶細(xì)胞空泡化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架重排，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此是Hp重要的毒力因子。僅僅發(fā)現(xiàn)于1983年的Hp現(xiàn)在是研究得最深入的病原體之一,現(xiàn)就近幾年來研究較多的Hp毒力因子VacA綜述如下。
    1  VacA蛋白基因結(jié)構(gòu)和基因型
    1.1  VacA的基因結(jié)構(gòu)  T.L.Cover于1993年克隆出了VacA的基因，發(fā)現(xiàn)其由3864個堿基對組成，編碼1287個氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量為139kDa，此為VacA的前體分子，包括三個區(qū)域：（1）N-末端為33個氨基酸殘基組成的前導(dǎo)信號序列；（2）中間區(qū)域?yàn)槌墒斓目张荻舅�；�?）C-末端為50kDa的多肽，其氨基酸順序與許多G＋細(xì)菌的外膜蛋白有同源性。在去掉N末端的信號肽，C末端的類似于IgA蛋白酶前體的肽鏈等修飾后，成為成熟的87kDa的VacA。該活性毒素可降解為37kDa及58kDa兩個亞單位。
    VacA可能是具有A-B結(jié)構(gòu)的細(xì)菌毒素家族，B亞單位與靶細(xì)胞表面的膜受體結(jié)合并介導(dǎo)A亞單位進(jìn)入胞漿，A亞單位與細(xì)胞內(nèi)靶分子特異性共價結(jié)合后，導(dǎo)致細(xì)胞重要功能的破壞，從而發(fā)揮毒素活性［1］。
    從液體培養(yǎng)上清中提純的VacA是一個分子量大于900kDa的寡聚復(fù)合物，完整的VacA分子呈花瓣?duì)罨蜓┗�狀，�?～7個沿半徑對稱的95kDa的VacA單體組成［2］。VacA暴露于酸性pH下可使得寡聚復(fù)合物解聚為單體并與VacA細(xì)胞毒性的增強(qiáng)有關(guān)。
    1.2  VacA的基因型  根據(jù)VacA5，末端序列的不同，可分為2個不同的類型：s1(包括s1a,s1b2個亞型)，s2；根據(jù)中間序列的不同又可分為2個類型：m1和m2。這些等位基因理論上產(chǎn)生的重組體除s2/m1外（推測s2/m1型可能是致死性的），經(jīng)證實(shí)都存在。因此，根據(jù)VacA序列的不同可將Hp分為s1/m1、s1/m2、 s2/m2。美國的Hp菌株以s1/m1亞型為主，而中國的則以s1/m2亞型占優(yōu)勢［3］。
    2  VacA的生物學(xué)活性
    2.1  VacA的空泡化作用  VacA誘導(dǎo)細(xì)胞空泡形成，這些空泡的膜包含晚期胞內(nèi)體和晚期溶酶體的標(biāo)志物［4］�？张莸男纬珊途S持所需的一些細(xì)胞內(nèi)的酶已被證實(shí)，這包括空泡ATP酶［5］和小GTP結(jié)合蛋白Rab7［6］Rac1［7］。其中空泡ATP酶能夠調(diào)整通過細(xì)胞內(nèi)間隔膜上的氫離子的流量，因此對于空泡ATP酶的需要提示空泡前體腔內(nèi)的pH必須是酸性的以便VacA誘導(dǎo)細(xì)胞空泡形成。Rab7是調(diào)節(jié)膜上的離子通道與促進(jìn)溶酶體融合的GTP酶,位于晚期內(nèi)體膜上,并且是晚期內(nèi)體的標(biāo)志物。支持膜沉積及晚期內(nèi)體之間的同型融合。而Rac1則控制影響膜運(yùn)輸?shù)募?xì)胞骨架成分。即使在檢測不到空泡化的情形下，VacA也能改變晚期吞噬途徑和溶酶體的功能。有研究顯示VacA的空泡化作用受Hp尿素酶的影響，因尿素酶能分解尿素產(chǎn)氨，而氨能促進(jìn)VacA的空泡化作用。
    2.2  VacA干擾組織細(xì)胞損傷修復(fù)機(jī)制  VacA能特異地抑制細(xì)胞增殖，延緩潰瘍的愈合。最近研究表明VacA參與表皮生長因子（EGF）激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，F(xiàn)ujiwara等［8］在研究Hp毒素及EGF對胃癌KatoⅢ細(xì)胞共同作用的過程中發(fā)現(xiàn)，不影響細(xì)胞活力的VacA毒素劑量可顯著抑制EGF與表皮生長因子受體（EGFr）的結(jié)合，并減少EGF刺激引起的細(xì)胞增殖達(dá)22%。Pai等［9］用EGF作用于胃癌KATOⅢ細(xì)胞后，可以增強(qiáng)EGFr的表達(dá)及其自身磷酸化，VacA可以抑制上述過程。由上可知,VacA干擾了EGF介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路�？赡苁荲acA與RPTPβ的結(jié)合促進(jìn)EGF受體蛋白酪氨酸的去磷酸化，導(dǎo)致EGF作用減弱，因而干擾上皮修復(fù)并延遲潰瘍愈合。
    2.3  VacA對機(jī)體免疫的影響  Molinari等［10］研究了VacA對抗原處理細(xì)胞前溶酶體內(nèi)抗原呈遞過程的影響，結(jié)果表明，VacA可以特異性的抑制由MHC-Ⅱ類抗原介導(dǎo)的抗原呈遞過程，表明VacA可干擾機(jī)體保護(hù)性免疫而有利于Hp在胃內(nèi)持續(xù)感染，引起相應(yīng)的臨床癥狀。
    2.4  VacA對于細(xì)胞功能的其他作用 
    2.4.1  引起細(xì)胞凋亡  VacA能引起線粒體去極化并部分損耗細(xì)胞內(nèi)的ATP，但這在體外試驗(yàn)中對細(xì)胞不是致死的［11］。人類的胃細(xì)胞對VacA非常敏感，VacA進(jìn)入線粒體伴隨著凋亡，這與線粒體釋放細(xì)胞色素C和caspase3活化有關(guān)，細(xì)胞中毒2天后就有細(xì)胞死亡。體內(nèi)的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明還有其他的刺激因素存在，cag＋和表達(dá)VacA的Hp株在體內(nèi)和體外所激發(fā)的胃上皮細(xì)胞的凋亡率更高［12］。
    2.4.2  引起細(xì)胞骨架重排  VacA能影響或與細(xì)胞骨架的多種成分相互作用引起肌動蛋白重排、Rac-1的改變，而且還能使微管網(wǎng)絡(luò)解體。這些現(xiàn)象與VacA誘導(dǎo)的細(xì)胞增生有關(guān)。 
    2.4.3  其他作用  VacA還能使第二信使產(chǎn)生增加,刺激AGS細(xì)胞分泌胃蛋白酶原，增強(qiáng)Hp的侵襲力。不過這些發(fā)現(xiàn)還有待于進(jìn)一步研究。
    3   VacA的作用機(jī)制
    3.1  VacA結(jié)合細(xì)胞受體  VacA結(jié)合到真核細(xì)胞表面是細(xì)胞中毒的第一步。3種細(xì)胞表面蛋白被認(rèn)為是VacA的受體：（1）AGS細(xì)胞表面的140kDa蛋白；（2）HeLa細(xì)胞的EGF受體；（3）RPTPβ。在這3種假定的受體當(dāng)中，VacA與RPTPβ的相互作用已被證實(shí)。 
    s1/m1型VacA能引起許多不同細(xì)胞的空泡化，因此認(rèn)為其能有效的結(jié)合這些細(xì)胞系。相反，s1/m2型VacA也能引起一些細(xì)胞系的細(xì)胞產(chǎn)生空泡而對另一些則作用甚微。這表明s1/m1型VacA和s1/m2型VacA結(jié)合的細(xì)胞類型不同，因?yàn)樗鼈冎�間的主要區(qū)別在于p58的C－末端，提示毒素結(jié)合細(xì)胞所需的氨基酸序列位于p58內(nèi)［13］。p58的抗體能抑制VacA結(jié)合HeLa細(xì)胞，而且GST-p58融合蛋白能結(jié)合HeLa細(xì)胞。
    3.2  VacA－膜相互作用  研究表明［14］活化的VacA能插入脂質(zhì)體膜而未活化的VacA卻不能，此相互作用引起離子和熒光分子的釋放。低pH活化VacA引起疏水端暴露的增加，因?yàn)榈蚿H活化與可溶的VacA寡聚體解離為單體有關(guān)，以前隱藏的疏水端的暴露可能涉及到膜的插入。屬于VacAp37的三個區(qū)域在膜插入后變得能抵御蛋白酶的消化，這提示此三個區(qū)域不是插入脂質(zhì)雙層就是轉(zhuǎn)位到脂質(zhì)體膜腔，大部分p58留在膜外。
    3.3  VacA的內(nèi)化  VacA結(jié)合到細(xì)胞表面之后慢慢的內(nèi)化。p58介導(dǎo)的表面受體的結(jié)合對于接下來中毒的步驟來說是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。事實(shí)上，一個僅含p58的缺失變異的VacA能結(jié)合細(xì)胞但不能內(nèi)吞［15］。因此，在毒素內(nèi)化過程中可能存在其他的相互作用，或是由p37N－末端介導(dǎo)的，或是依賴于VacA的寡聚化［16］。內(nèi)化是細(xì)胞空泡化的必要步驟。
    3.4  VacA在細(xì)胞內(nèi)的活性  VacA內(nèi)化后提示其能在內(nèi)化位點(diǎn)發(fā)揮毒性作用。為測試這個假設(shè)，HeLa細(xì)胞被轉(zhuǎn)染了編碼VacA的質(zhì)粒，當(dāng)其在胞質(zhì)中表達(dá)時，VacA誘導(dǎo)的空泡形成與外加的VacA誘導(dǎo)的空泡性質(zhì)一樣［17］。免疫熒光分析顯示細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的VacA以一種可溶的形式存在于胞質(zhì)和正在空泡化的腔室中。Galmiche等［18］報(bào)道表達(dá)在HEp－2細(xì)胞質(zhì)的全長VacA和p34能遷移到線粒體基質(zhì)，而p58卻保留在胞質(zhì)中，這些證據(jù)表明VacA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后能進(jìn)一步轉(zhuǎn)位通過線粒體膜。 
    3.5  離子通道的形成  實(shí)驗(yàn)顯示插入脂質(zhì)雙層的酸活化的VacA能引起通道形成，而此通道是具離子選擇性的。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為通道的形成在VacA誘導(dǎo)典型的空泡形成中起了直接的作用,可能原因是內(nèi)化的毒素在晚期胞內(nèi)體間隔上形成陰離子選擇性的通道,對陰離子滲透性的增加會增加空泡型ATP酶的作用,從而導(dǎo)致CL與具有滲透性的胺鹽在胞內(nèi)體腔中積聚,進(jìn)而導(dǎo)致胞內(nèi)體的腫脹與融合,最后形成空泡。抑制實(shí)驗(yàn)顯示阻礙VacA通道形成的復(fù)合物同樣抑制了空泡的形成，而且有效性相同，這充分說明了VacA的孔形成活性是其細(xì)胞毒性所必需的。Szabo等［19］進(jìn)一步證實(shí)了VacA能增強(qiáng)Hela細(xì)胞膜上的離子選擇性通道,并使其去極化。VacA的氨基末端親水區(qū)能促進(jìn)毒素的插入，因此缺失了氨基末端的VacA既不能誘導(dǎo)空泡形成也不能形成通道，蛋白分析也顯示p34對于通道的形成起重要作用。 
    4  VacA的臨床意義 
    4.1  VacA的臨床相關(guān)性  1989年Figura［20］等比較了從77例胃潰瘍病人和胃炎病人中分離出的Hp菌株的細(xì)胞毒素的產(chǎn)生。他們發(fā)現(xiàn)從胃潰瘍病人當(dāng)中分離出的菌株66.6％能產(chǎn)生細(xì)胞毒素，而從胃炎病人中分離出的只有30.1%,這種顯著的差異表明細(xì)胞毒素可能與胃潰瘍的產(chǎn)生密切相關(guān)。此外，Atherton［21］等發(fā)現(xiàn)了vacAs1基因型與胃潰瘍的重要相關(guān)性。vacAs1基因型與胃癌也具同樣的相關(guān)性。
    4.2  VacA作為未來疫苗的前景  Hp能定居在小鼠的胃內(nèi)，Ⅰ型菌株的感染可引起與人類疾病相似的胃部病變，使用純化的VacA和E.coil不耐熱腸毒素作為佐劑免疫這種小鼠模型可保護(hù)其免遭Ⅰ型菌株的感染。說明VacA有免疫原性，可作為預(yù)防Hp感染的疫苗。
    從Hp培養(yǎng)上清液中高度純化的VacA有生物學(xué)活性，免疫家兔后可誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生中和抗體。其血清研究顯示其包含大部分能夠識別構(gòu)象表位的抗體。說明空泡毒素在體內(nèi)有構(gòu)象變化,因此針對VacA的免疫應(yīng)答的建立依賴于VacA天然的構(gòu)造，針對重組VacA的抗血清不能中和空泡活性，而且也不能識別天然的VacA，那么對于這種空泡毒素的疫苗只有使用完整的分子才可能有效。但是由于聚集的問題，尚未合成有活性的VacA，但是天然的VacA能通過甲醛脫毒，甲�；�的VacA仍然能夠結(jié)合靶細(xì)胞，但沒有空泡活性，盡管其誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體與天然未經(jīng)處理的VacA誘導(dǎo)產(chǎn)生的相比有一些改變但仍被成功地應(yīng)用于保護(hù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中。