Digital PCR 技術的發(fā)展與應用詳述
Digital PCR，綻放正當時！
dPCR發(fā)展歷史
1992年，Sykes等從非淋巴細胞和正常體細胞背景中鑒定突變的白血病細胞，檢測了復雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因。該研究中提出了三個重要的原則：有限稀釋、終點信號的有或無及對數據泊松分布的統計處理，為以后dPCR的發(fā)展奠定了基礎。
1997年，有研究利用玻璃毛細管作為載體進行PCR反應，可以對模板分子進行定量，驗證了Taq-Man探針可以檢測模板單分子，尤其在微小的反應體系中，發(fā)展了單分子定量技術，為dPCR單模板擴增提供了技術支持。
1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W. Kinzler正式提出了dPCR的概念，他們在結腸癌患者糞便中檢測KRAS基因突變時，首先把樣本分配到384孔板中，然后分別用不同熒光檢測突變基因和正�；颍ㄟ^計算突變基因和正�；虻谋壤齺淼贸鐾蛔兟省�
2003 年 Dressman 等 發(fā) 明 了 一 種BEAMing 方法(珠子、乳劑、擴增與磁力) 。BEAMing 將模板、引物、PCR 試劑和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多數的小滴不含有或只含有一個模板。PCR 完成后，其中擴增產物會通過生物素——鏈酶親和素的鍵合關聯在磁珠上，乳化物隨之會被打散，珠子就能通過與檢測寡核苷酸和流式細胞儀的雜交物所讀取。
2006年 Fluidigm公司推出了第一臺基于芯片的商品化數字PCR系統。隨后，QuantaLife 利用油包水微滴生成技術開發(fā)了微滴式數字PCR技術。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購，其微滴式數字PCR儀產品更名為QX100型號儀，2013年該公司又推出了升級型號QX200。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D數字PCR系統。
商業(yè)化數字PCR平臺的概述
| 類型 | 供應商 | 生產時間 | 儀器型號 | 分液數目 | 特點 |
| 芯片式 |
Fluidigm | 2006 | EP1 | 36,960 | 基于集成流體通路芯片，快速準確地將流體分成獨立的單元。操作耗時，反應成本高。 |
| 2006 | BioMark HD | 9180 | |||
| Life Technologi-es | 2009 | Open Array | 3072 | 反應重復的數量可輕松調整，以滿足應用需求。 樣品之間完全隔離，防止交叉污染。反應的通量 較低。 |
|
| 2009 | QuantStudio 12K Flex | 3072 | |||
| 2013 | QuantStudio 3D |
20,000 | |||
| 微滴式 | Bio-Rad | 2011 | QC100 | 20,000 | 基于油包水技術，大量的微滴提供了足夠的精確度，能準確測定樣品拷貝數�？赏瑫r進行96個樣本反應。 |
| 2013 | QX200 | 20,000 | |||
| RainDance | 2012 | RainDrop | 10,000,000 | 皮升級反應微滴，提供更高的檢測動態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品。 |
基本原理
dPCR的原理是將含有核酸模板的標準PCR反應體系，平均分配成上萬個和數百萬個PCR 反應，分配到芯片或微滴中，使每個反應中盡可能含有一個模板分子，進行單分子模板PCR反應，利用標記的探針檢測特定的靶序列,通過讀取熒光信號的有或無，計算兩種信號類型的反應單元比例和數目，經過統計學泊松分布的校準進行絕對定量。
根據數字PCR 反應單元總數和有熒光信號的單元數以及樣品的稀釋倍系數,就可以得到樣本的最初拷貝數(濃度)。
不同于 qPCR對每個循環(huán)進行實時熒光測定的方法，dPCR 技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集，最后根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度。
根據大量獨立反應單元實現方式的不同，dPCR又細分為基于液滴式微流控（droplet microfluidics）的微滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和基于芯片式微流控的微陣列芯片式數字PCR（chip digital PCR，cdPCR）。
微流控芯片數字PCR
隨著微流芯片技術的發(fā)展，數字 PCR 借助微流芯片，可以把樣本準確并且快速的分成若干個獨立的反應單元，各個單元之間互不影響，可以多步反應同時進行。提高反應通量的同時也降低了反應消耗成本。目前Fluidigm公司的Bio-Mark TM 基因分析系統，Life Technologies公司QuantStudio TM 3D數字 PCR系統均均為采用微流控芯片技術的數字PCR系統。
液滴數字PCR
數字PCR源于乳液PCR(emulsion PCR)技術 ，利用微滴發(fā)生器可以一次生成數萬乃至數百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴,作為數字PCR的樣品分散載體，PCR反應結束后檢測每個微滴的熒光信號。目前Bio-Rad公司的QX100系統、 QX200系統均為采用液滴技術的數字PCR系統。
數字PCR與實時熒光定量PCR的比較
| 方法 | 原理 | 應用 | 優(yōu)點 | 缺點 |
| 數字PCR | 將PCR反應體系進行分液，PCR擴增，通過統計陽性反應和陰性反應的數目，直接得出樣品的拷貝數 | 病毒載量的絕對定量；拷貝數變異分析；罕見突變的檢測；基因表達定量；二代測序文庫分析等 | 絕對定量，不需要標準曲線，靈敏度高，對PCR反應抑制劑的耐受能力更 強 |
檢測的動態(tài)范圍要小，容易產生假陽性，成本較高 |
| 實時熒光定量PCR | 擴增產物的量與熒光信號強度成正比，通過反應的循環(huán)閾值及標準曲線，對樣品定量 | 病原體的檢測與定量；基因表達的相對檢測；單核苷酸多態(tài)性分析；腫瘤標志物的檢測等 | 檢測的動態(tài)范圍廣，應用范圍廣，成本較低 | 擴增效率易受PCR反應抑制劑的影響 |
應用
dPCR技術具有以下的優(yōu)勢：
(1)高靈敏度。dPCR本質上將一個傳統的PCR反應變成了數萬個PCR反應，在這數萬個反應單元中分別獨立檢測目的序列，從而大大提高了檢測的靈敏度。
(2)高精確度。dPCR通過計算在數萬個反應單元中陽性反應單元數量和比例，可以精確地檢測出變化很小的目的序列差異。
(3)高耐受性。dPCR技術第一步反應體系分配的過程，可以使背景序列和PCR反應抑制物被均勻分配到每個反應單元，而大部分反應單元中并不含有目的序列，低豐度的目的序列被相對富集于某些反應單元中，從而顯著地降低了這些反應單元中背景序列和抑制物對反應的干擾。另外，dPCR在對每個反應單元進行結果判讀時僅判斷陽性／陰性兩種狀態(tài)，不依賴于Ct值，受擴增效率的影響大為降低，對背景序列和抑制物的耐受能力也大大提高。
(4)絕對定量。PCR直接計算目的序列的拷貝數，無需依賴于Ct值和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測。
dPCR的以上優(yōu)點使其特別適合于以下方面的應用：
| 領域 | 應用實例 |
| 臨床診斷 | 無創(chuàng)產前診斷 |
| 癌癥標志物檢測 | |
| 病毒檢測 | |
| 拷貝數變異分析 | |
| 稀有突變檢測 | |
| 基因表達分析 | 復雜樣品基因表達分析 |
| 單細胞基因表達分析 | |
| 下一代測序 | 測序結果驗證 |
| 測序文庫質控 | |
| 基因成分定量 | 轉基因成分分析 |
| 微生物檢測 | 水樣微生物檢測 |
| 病原微生物檢測 |
dPCR作為核酸定量的新技術，與此前的核酸定量方法相比，方法的靈敏度、準確度更高。dPCR為分子生物學、微生物學等領域提供了新的檢測方法和實驗思路。從應用的范圍、實驗的成本角度來看，dPCR不可能完全取代qPCR，但是dPCR方法可以進行精準的絕對定量分析，極好的數據重現性，而且樣本需求較低，在核酸檢測與定量等方面有非常重要的補充。在整個dPCR的發(fā)展過程中，應用越來越廣泛，在核酸檢測定量、抗病毒治療監(jiān)測、預后判斷具有重要的意義。隨著dPCR技術和商品化平臺的發(fā)展，dPCR的通量將會更高，成本更低，在科學研究領域將會發(fā)揮更重要的作用。
參考文獻
- 殷海月,數字PCR,東華大學.
- 中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所,關于“數字 PCR 發(fā)展、原理、運用和前景”調查匯報，2017.3.
- 詹成,燕麗等.數字PCR技術的發(fā)展和應用[J].復旦學報（醫(yī)學版）,2015 Nov., 42(6).
- 馮兆民,舒躍龍. 數字PCR技術及其應用進展[J]. 病毒學報 Vol. 33 No. 1 January 2017.
- 林彩琴,姚波.數字PCR技術進展[J].化工進展,2012 Dec., 24(12).
- Jeffrey M. Perkel;高大海,姜天海譯. 數字PCR革命,英文原文由美國科學促進會發(fā)布在2014 年4月11日《科學》雜志.
