液相色譜是一類分離與分析技術(shù)，其特點是以液體作為流動相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜技術(shù)發(fā)展的過程中，為了區(qū)分各種方法，根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名，如，紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。
 
一、對液相色譜儀的要求
 
⒈流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45μm或更細的膜過濾)。
 
⒉流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。
 
⒊不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進液。
 
⒋使用緩沖溶液時，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20mL以上。
 
⒌長時間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機相(如，甲醇等)，因為，純水易長霉。
 
⒍每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器。
 
⒎C18柱絕對不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品。
 
⒏堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗，清洗方法：
 
①以異丙醇作溶劑沖洗；
 
②放在異丙醇中間用超聲波清洗；
 
③用10％稀硝酸清洗；
 
⒐氣泡會致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。
 
⒑如果進液管內(nèi)不進液體時，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進行流動相的清洗。
 
⒒要注意柱子的pH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。
 
⒓更換流動相時應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊靖洗，然后插入新的流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下。
 
二、常見故障斷定及解決方法
 
⒈保留時間變化
 
⑴柱溫變化：柱恒溫，必要時需配置恒溫箱。
 
⑵等度與梯度間未能充分平衡：至少用10倍柱體積的流動相平衡柱。
 
⑶緩沖液容量不夠：用》25mmol/L的緩沖液。
 
⑷柱污染：每天沖洗柱。
 
⑸柱內(nèi)條件變化：穩(wěn)定進樣條件,調(diào)節(jié)流動相。
 
⑹柱快達到壽命：采用保護柱。
 
⒉保留時間縮短
 
⑴流速增加：檢查泵,重新設(shè)定流速。
 
⑵樣品超載：降低樣品量。
 
⑶鍵合相流失：流動相pH值保持在3~7.5檢查柱的方向。
 
⑷流動相組成變化：防止流動相蒸發(fā)或沉淀。
 
⑸溫度增加：柱恒溫。
 
⒊保留時間延長
 
⑴流速下降：管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡。
 
⑵硅膠柱上活性點變化：用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱。
 
⑶鍵合相流失：流動相pH值保持在3~7.5檢查柱的方向。
 
⑷流動相組成變化：防止流動相蒸發(fā)或沉淀。
 
⑸溫度降低：柱恒溫。
 
⒋出現(xiàn)肩峰或分
 
⑴樣品體積過大：用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%。
 
⑵樣品溶劑過強：采用較弱的樣品溶劑。
 
⑶柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件。
 
⑷柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效：更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品。
 
⑸進樣器損壞：更換進樣器轉(zhuǎn)子。
 
⒌鬼峰
 
⑴進樣閥殘余峰：每次用后用強溶劑清洗閥,改進閥和樣品的清洗。
 
⑵樣品中未知物：處理樣品。
 
⑶柱未平衡：重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑 (尤其是離子對色譜)。
 
⑷三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜) ：每天新配,用抗氧化劑。
 
⑸水污染(反相) ：通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水。
 
⒍基線噪聲
 
⑴氣泡(尖銳峰) 流動相脫氣：加柱后背壓。
 
⑵污染(隨機噪聲) ：清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑。
 
⑶檢測器燈連續(xù)噪聲：更換氘燈。
 
⑷電干擾(偶然噪聲)：采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)。
 
⑸檢測器中有氣泡：流動相脫氣,加柱后背壓。
 
⒎峰拖尾
 
⑴柱超載：降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相。
 
⑵峰干擾：清潔樣品,調(diào)整流動相。
 
⑶硅羥基作用：加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品。
 
⑷柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效：更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品。
 
⑸柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件。
 
⑹死體積或柱外體積過大：連接點降至最低,對所有連接點作合適調(diào)整,盡可能采用細內(nèi)徑的連接管。
 
⑺柱效下降：用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護柱。
 
⒏峰展寬
 
⑴進樣體積過大：用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%。
 
⑵在進樣閥中造成峰擴展L進樣前后排出氣泡以降低擴散。
 
⑶數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢 : 設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點。
 
⑷檢測器時間常數(shù)過大 : 設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%。
 
⑸流動相粘度過高 : 增加柱溫,采用低粘度流動相。
 
⑹檢測池體積過大 : 用小體積池,卸下熱交換器。
 
⑺保留時間過長 : 等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫。
 
⑻柱外體積過大 : 將連接管徑和連接管長度降至最小。
 
⑼樣品過載 : 進小濃度小體積樣品。

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