KinExA分子與完整細(xì)胞相互作用系統(tǒng)的原理與應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：7491　發(fā)布日期：2018-11-2　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

KinExA®分子與細(xì)胞相互作用系統(tǒng)介紹

一、KinExA的技術(shù)背景：

Sapidyne Instruments Inc.于1995年在美國創(chuàng)立，產(chǎn)品基于獨特的Kinetic Exclusion Assay（KinExA）專利技術(shù)。在公司成立早期，Xavier大學(xué)、美國陸軍和環(huán)境保護局等研究單位采用KinExA技術(shù)開展了大量工作；經(jīng)過數(shù)十年在生物制藥領(lǐng)域、科研領(lǐng)域及環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，KinExA技術(shù)已成為頂級制藥公司和生物技術(shù)公司以及許多大學(xué)、獨立研究實驗室和環(huán)境監(jiān)測機構(gòu)研究相互作用和生物活性物質(zhì)檢測的必備工具，并且已得到FDA和EMA認(rèn)可。

二、KinExA的技術(shù)原理：

在反應(yīng)溶液中當(dāng)受體和配體達(dá)到平衡狀態(tài)時，這時溶液中存在三種物質(zhì)：受體、配體以及受體-配體復(fù)合物。KinExA技術(shù)通過包被受體或配體的珠子在極短時間內(nèi)（<0.5s，不影響反應(yīng)平衡）捕獲游離的配體或受體，再通過熒光標(biāo)記的抗體檢測游離的配體或受體的量。檢測過程如下：

三、KinExA與SPR的區(qū)別

1、與SPR的區(qū)別：SPR在芯片表面固定一個分子，通過芯片表明與溶液間二維相互作用的物質(zhì)量改變而實現(xiàn)SPR檢測。這就帶來了非常顯著的缺點：固定在芯片上的生物分子可能不能維持其天然活性、質(zhì)量遷移影響動力學(xué)分析（例如，流速會影響實驗結(jié)果）、被檢測分子有分子量下限限制、非常大的分子或者生物結(jié)構(gòu)其分子量有上限限制、樣品需要純化及無法檢測完整細(xì)胞。相反，KinExA分析三維水平及游離狀態(tài)相互作用，不固定任何分子、不會對平衡帶來影響、沒有質(zhì)量遷移的限制、可以檢測未純化樣品和完整細(xì)胞；因此，極寬范圍內(nèi)的生物分子、生物結(jié)構(gòu)及完整細(xì)胞均可靈活分析。

2、與SPR技術(shù)對比：為了表征治療性單克隆抗體候選分子，研究者采用不同類型芯片，從Biacore系統(tǒng)獲得同一組單抗-抗原的53組數(shù)據(jù)，與KinExA實驗數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，親和力及動力學(xué)數(shù)據(jù)與所使用的芯片類型有關(guān)，帶負(fù)電荷的CM5，CM4及CM1芯片對Biacore的動力學(xué)數(shù)據(jù)有不利的影響。為了驗證這一假設(shè)，作者通過Biacore液相實驗，KinExA平衡態(tài)滴定以及KinExA動力學(xué)實驗，精確計算抗體與抗原的親和力及動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明隨著芯片表面負(fù)電荷的降低，親和力及動力學(xué)參數(shù)與液相實驗所得的結(jié)果越接近�？赡艿脑颍海�1）帶負(fù)電荷的葡聚糖芯片與抗體之間的空間位阻影響抗原的結(jié)合；（2）帶負(fù)電荷的抗原與芯片表面的負(fù)電荷靜電排斥。

表中的結(jié)果說明：對于Biacore技術(shù)，不同的固定方式（氨基偶聯(lián)，捕獲）以及不同的芯片，對實驗結(jié)果均有明顯影響。而采用KinExA技術(shù)，溶液中加葡聚糖，對結(jié)果也無明顯影響。

Drake A.W., et al. 2012. Biacore surface matrix effects on the binding kinetics and affinity of an antigen/antibody complex. Anal Biochem. 429(1):58-69.

四、KinExA的應(yīng)用：

應(yīng)用一、KinExA在CAR-T細(xì)胞治療中的應(yīng)用

因多種因素的限制，自體CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品可能在應(yīng)用于患者前未必能夠進(jìn)行全部項目的檢定，所以工藝驗證非常重要。工藝研究及驗證必須結(jié)合工藝的實際情況設(shè)定相應(yīng)的驗證參數(shù)，CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品工藝研究在不斷發(fā)展，到目前為止，業(yè)界對何種工藝最好并未達(dá)成共識。因此，可以在產(chǎn)品研發(fā)過程及早期臨床試驗階段開展不同程度的工藝驗證研究，工藝驗證完成后，應(yīng)在關(guān)鍵工藝步驟設(shè)置關(guān)鍵過程控制參數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)，以提高CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)一致性。

CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制研究及檢測項目一般應(yīng)包括：細(xì)胞數(shù)量及其存活率、細(xì)胞表型、CAR陽性率檢測、生物學(xué)效力檢測，無菌檢測、支原體、熱原/內(nèi)毒素的檢測、CAR-T細(xì)胞中病毒載體拷貝數(shù)及整合的檢測等。如果能夠檢測CAR-T細(xì)胞與抗原分子的親和力，以及CAR-T細(xì)胞上抗體的表達(dá)量，無疑會提升CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

目前市面上除了KinExA技術(shù)外，沒有其他特別有效的方式檢測完整細(xì)胞與分子間的親和力，更無從判斷細(xì)胞上分子的表達(dá)量。KinExA技術(shù)可以檢測細(xì)胞與分子間的親和力，并且可以計算細(xì)胞上分子的表達(dá)量。其檢測原理如下圖，先將梯度稀釋的細(xì)胞與恒定濃度的分子共同孵育達(dá)到平衡，離心之后收集上清液（此時上清液中只存在游離的分子），再通過已提前包被過的珠子捕獲游離的分子，用熒光標(biāo)簽的抗體檢測游離分子的量，通過檢測器檢測得到相應(yīng)的數(shù)值后，利用KinExA系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

下圖是國內(nèi)某知名CAR-T公司通過KinExA技術(shù)檢測CAR-T細(xì)胞與抗原分子間相互作用的結(jié)果。

結(jié)果表明，CAR-T細(xì)胞與抗原的親和力Kd為45.41pM，T細(xì)胞表面CAR的表達(dá)水平為1.368e+5，Kd與EL的95%置信區(qū)間均較窄，數(shù)據(jù)非常準(zhǔn)確可信。

應(yīng)用二、KinExA在高親和力檢測上應(yīng)用

對于抗腫瘤藥市場，目前精準(zhǔn)醫(yī)療最為成熟的領(lǐng)域還是以靶向藥物為代表的抗腫瘤藥物。由于單克隆抗體類抗癌藥的副作用較小，且靶向性更好，因此，單抗藥物仍將是引領(lǐng)抗腫瘤藥物發(fā)展最為重要的領(lǐng)域。以PD-1為靶點的一類單抗藥呈現(xiàn)出較高的親和力，常規(guī)的相互作用檢測系統(tǒng)例如SPR 、BLI、ITC等由于自身原理的限制均不能檢測高親和力（pM級別）。KinExA技術(shù)有別于常規(guī)的相互作用檢測系統(tǒng)，能準(zhǔn)確有效的檢測高親和力（fM級別）。

下表是Pfizer, Rinat兩家公司聯(lián)合發(fā)表的KinExA高親和力檢測范圍的文章。

Bee C., et al. 2012. Exploring the dynamic range of the kinetic exclusion assay in characterizing antigen-antibody interactions. PLOS ONE 7(4): e36261.

五、案例分析

案例一：完整細(xì)胞的相互作用檢測

背景：單克隆抗體XMetA是胰島素受體（IR）變構(gòu)部分的激動劑，其激活代謝Akt激酶信號通路，而對有絲分裂胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路幾乎沒有影響。為了研究這種選擇性信號通路的性質(zhì)，作者驗證了XMetA對CHO細(xì)胞中IR，Akt和ERK的特異性磷酸化和活化的影響。

目的：完整細(xì)胞親和力檢測。

方法：研究者將表達(dá)短鏈型（IR-A）及長鏈型（IR-B）胰島素受體的不同濃度CHO細(xì)胞分別與XMetA孵育，通過離心獲得游離的XMetA，用KinExA儀器檢測親和力。另外，作者采取同樣的策略，用KinExA儀器檢測胰島素與CHO細(xì)胞表面IR-A，IR-B的親和力。

結(jié)論：XMetA與IR-A亞型的親和力為55±16pM，與IR-B亞型的親和力為50±11pM。另外，在對照抗體組，胰島素與IR-A亞型的親和力為156±14pM；在XMetA組，胰島素與IR-A亞型的親和力為216±100pM；在對照抗體組，胰島素與IR-B亞型的親和力為221±28pM；在XMetA組，胰島素與IR-B亞型的親和力為277±112pM。數(shù)據(jù)同時說明， XMetA與IR亞型的結(jié)合與胰島素?zé)o關(guān)。

Bedinger, D., et al. 2015. Differential pathway coupling of activated insulin receptor drives signaling

selectivity by XmetA, an allosteric partial agonist antibody. J Pharmacol Exp Ther 353(1):35-43.

案例二：細(xì)胞與上清未純化樣品檢測

背景：單克隆抗體（mAb）在體內(nèi)與膜蛋白間親和力的可靠評估是腫瘤治療的主要問題。在BV展示系統(tǒng)中，膜蛋白能以天然狀態(tài)在病毒表面展示。

目的：細(xì)胞與上清中未純化樣品親和力檢測。

方法：研究者基于KinExA技術(shù)，結(jié)合桿狀病毒（BV）膜蛋白展示系統(tǒng)，描述了一個簡單而高度敏感的單克隆抗體評估方法。

結(jié)論：在BV表面展示的肝癌抗原Robo1吸附到磁珠上（BV beads）,其KD值(~10pM)與全細(xì)胞分析方法一致（R2=0.998），表明基于KinExA技術(shù)檢測方法提供了針對細(xì)胞表面蛋白的單克隆抗體親和力準(zhǔn)確的評估。

Kusano-Arai 0., et al. 2016. Kinetic exclusion assay of monoclonal antibody affinity to the membrane protein Roundabout 1 displayed on baculovirus. Anal Biochem.

案例三：高親和力檢測

背景：白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）是炎癥反應(yīng)的有效介質(zhì)，在許多淋巴細(xì)胞的分化中發(fā)揮調(diào)控作用。在一些炎癥和自身免疫性疾病中，血清中IL-1β水平與疾病的發(fā)展和嚴(yán)重程度相關(guān)。 IL-1β在一些疾病中的機理已經(jīng)被臨床試驗證實，并獲得FDA的審批。

目的：高親和力檢測與驗證。

方法：設(shè)計抗IL-1β抗體XOM052，SPR檢測其與IL-1β的親和力為≤4pM。另外實驗采用Protein A捕獲IL-1β抗體，解離10min，發(fā)現(xiàn)時間不足以使抗體抗原發(fā)生解離，將解離時間延長至4h，解離早期無法準(zhǔn)確擬合，推測是由于IL-1β抗體從Protein A上解離對實驗造成的影響。為了更精確的計算親和力，作者改用KinExA，分析得到其親和力為300fM。

結(jié)論：KinExA技術(shù)對于高親和力的檢測具有無可替代的優(yōu)勢。