dPCR和qPCR(Real-time PCR)技術(shù)定量檢測(cè)DNA/RNA時(shí)抑制劑的影響對(duì)比

眾所周知，數(shù)以千種的化學(xué)物質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)有作用，而生物樣本往往都會(huì)含有類似的化合物，在DNA/RNA純化時(shí)，這類化合物很難去除，所以會(huì)存在DNA/RNA樣本中。

> qPCR和Crystal dPCR進(jìn)行DNA/RNA定量的比較

qPCR (Real-time PCR)進(jìn)行DNA/RNA定量時(shí)，基于Ct值，且依賴于分析的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過未知樣品與含有已知量核酸標(biāo)準(zhǔn)品之間的Ct值得到未知樣品的濃度。但當(dāng)樣品中存在抑制劑時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品之間由于背景不同，所以PCR反應(yīng)效率可能不同，因此定量結(jié)果將會(huì)有偏差（圖1A）。

Naica crystal dPCR進(jìn)行DNA/RNA定量時(shí)，結(jié)果判讀在于通過熒光值區(qū)分微滴的陽性或陰性。即使有因抑制劑存在而導(dǎo)致PCR反應(yīng)效率降低，仍然可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量（圖1B）。

圖1.腐殖酸在qPCR（A）和Crystal dPCR（B）系統(tǒng)分析中的影響比較

在qPCR和Crystal dPCR平臺(tái)檢測(cè)中PCR反應(yīng)均包含1X PerfeCta Multiplex qPCR Tough-mix，100 nM熒光素，500 nM ALB基因正向和反向引物，250 nM Cy5標(biāo)記TaqMan探針和5.4 ng / uL人類基因組DNA。分別摻入0, 50和100ug / mL的腐殖酸。

還有很重要的一點(diǎn)我們需要注意，抑制劑對(duì)于同一DNA/RNA樣品中不同靶標(biāo)基因絕對(duì)定量的影響也可能不同（圖2）。Naica Crystal dPCR系統(tǒng)有3個(gè)熒光通道，檢測(cè)您感興趣的基因上不同區(qū)域或基因組上不同的靶標(biāo)基因，以檢查這種偏差。

圖2.腐殖酸的存在對(duì)于Crystal dPCR中對(duì)不同靶標(biāo)的影響檢測(cè)

多重Crystal dPCR反應(yīng)中含有PerfeCta Multiplex qPCR Toughmix，ALB基因的引物和探針（Cy-5標(biāo)記），EGFR基因的引物和探針（HEX標(biāo)記）和BRAF的引物和探針（FAM標(biāo)記），并且使用相同量的人類基因組DNA摻入不同濃度的腐殖酸（利用Sigmoid即S型函數(shù)擬合）。以不添加抑制劑的DNA定量為0％抑制，計(jì)算抑制百分比。

> qPCR和Crystal dPCR對(duì)抑制劑的耐受性比較

我們?cè)趒PCR和Crystal dPCR平臺(tái)比較了存在兩種在樣品中發(fā)現(xiàn)的已知抑制劑對(duì)DNA定量分析的影響，分別是在土壤樣本中存在的腐殖酸和在收集的血樣中用作抗凝血?jiǎng)┑母嗡�。結(jié)果顯示，與qPCR相比，Crystal dPCR在任何較高濃度抑制劑存在的情況下，仍然可以進(jìn)行準(zhǔn)確定量（圖3）。

圖3. 不同濃度的腐殖酸（A）和肝素（B）對(duì)qPCR和Crystal dPCR的抑制。

qPCR和Crystal dPCR反應(yīng)包含PerfeCta Multiplex qPCR Toughmix，相同量的人類基因組DNA，以及測(cè)試腐殖酸抑制作用的靶向BRAF基因和測(cè)試肝素抑制作用的EGRF基因的引物和探針。所有樣品進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)三個(gè)重復(fù)（利用Sigmoid即S型函數(shù)擬合）。以不添加抑制劑的DNA定量為0％抑制，計(jì)算抑制百分比。

綜上所述，當(dāng)對(duì)存在抑制劑的樣品進(jìn)行DNA/RNA分析時(shí)，Crystal dPCR可以比qPCR的結(jié)果更為可靠。Crystal dPCR是您一直在尋找的針對(duì)含抑制劑樣本中核酸檢測(cè)和定量的最佳解決方案。