細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）是指病毒對(duì)組織培養(yǎng)細(xì)胞侵染后產(chǎn)生的細(xì)胞變性，是感染的標(biāo)志。CPE可通過相差顯微鏡或熒光顯微鏡觀察，但會(huì)產(chǎn)生光毒性，此次研究我們通過Nanolive數(shù)字全息斷層顯微術(shù)（DHTM）具有獨(dú)特的最小干擾的方式揭示活細(xì)胞中病毒感染的模式。DHTM通過無標(biāo)記的方式記錄低劑量的光通過透明樣本表面的相差位移。DHTM基于折射率（RI）推斷3維（3D）斷層圖像。通過測(cè)量RI和計(jì)算折射率梯度（RIG）值，DHTM在光學(xué)上揭示細(xì)胞在病毒感染時(shí)的異質(zhì)性。我們發(fā)現(xiàn)痘苗病毒（VACV）、單純皰疹病毒（HSV）和鼻病毒（RV）感染，RIG逐漸明顯增加。VACV，而不是HSV和RV感染引起細(xì)胞體積變化，但三種病毒都會(huì)改變細(xì)胞質(zhì)膜動(dòng)力學(xué)和誘導(dǎo)凋亡特征類似于化學(xué)復(fù)合物癌基因抑活藥，具有病毒特異性特征。

實(shí)驗(yàn)過程

用帶GFP標(biāo)簽的VACV病毒感染hela細(xì)胞，之后通過Nanolive 全息3D顯微鏡對(duì)感染早期到后期的細(xì)胞，非感染的細(xì)胞、阿糖胞苷處理的感染與非感染的細(xì)胞分別成像（2小時(shí)到8小時(shí)），記錄細(xì)胞折射率（RI）變化過程并標(biāo)成偽彩。

1. 對(duì)感染和非感染細(xì)胞感染早期和感染8小時(shí)成像，RI分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞感染8小時(shí)折射率梯度增加了3倍，而非感染的細(xì)胞，折射率梯度沒有改變，如下圖所示。

2.感染細(xì)胞、非感染細(xì)胞，阿糖胞苷處理的感染細(xì)胞，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)分別成像，分析折射率梯度變化，阿糖胞苷處理的感染細(xì)胞折射率僅增加了1.3倍，因阿糖胞苷會(huì)抑制VACV晚期基因的表達(dá)，該數(shù)據(jù)揭示細(xì)胞折射率梯度的改變主要由VACV晚期基因表達(dá)引起；且阿糖胞苷處理的感染細(xì)胞早期產(chǎn)生的濾泡比未處理的感染細(xì)胞多，后期和非處理的細(xì)胞沒有明顯的差別。

3.星形孢霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的折射率變化：0-4小時(shí)，折射率梯度逐漸增加，5小時(shí)后略有減少。

4.通過Nanolive全息3D成像技術(shù)，測(cè)量了不同處理細(xì)胞的體積大小，發(fā)現(xiàn)因細(xì)胞體積的變化，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)濃度增加，引起了細(xì)胞折射率梯度變化，從而全面揭示了病毒感染引起的細(xì)胞病變的效果及過程。

總之，我們引入的DHTM技術(shù)實(shí)現(xiàn)了感染性研究的無標(biāo)記定量分析，對(duì)活細(xì)胞以最小感染的方式揭示了病毒類型特異性變化及細(xì)胞病變。

經(jīng)典的視頻增強(qiáng)型相差光學(xué)顯微鏡，如干涉顯微鏡和亮場(chǎng)顯微鏡因衍射極限導(dǎo)致圖像不均勻，缺乏斷層信息和聚焦依賴的結(jié)構(gòu)膨脹，相反，DHTM可以延長定量時(shí)間分辨的3D圖像，通過低功率的激光（520nm,一級(jí)，0.2mW/mm2），不會(huì)在高時(shí)間和空間分辨率下產(chǎn)生光毒性。

總結(jié)：

Nanolive 的全息斷層3D成像技術(shù)優(yōu)于經(jīng)典光學(xué)技術(shù)，如層析相顯微鏡和衍射相顯微鏡，Nanolive不但高靈敏度、高精度，且采用非侵入性檢測(cè)。系統(tǒng)可在高空間和時(shí)間分辨率上獲得定量的3D信息。且可很容易地測(cè)量細(xì)胞體積及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，還可以用于獲取兩個(gè)新維度的細(xì)胞數(shù)據(jù)：RI及RIG,這是其他顯微成像系統(tǒng)不能評(píng)估的。這個(gè)算法強(qiáng)大，解決了活細(xì)胞病理成像的一系列技術(shù)限制，包括通過化學(xué)物或遺傳編碼的熒光素標(biāo)記細(xì)胞及病毒，成像過程中的光毒性等。非侵入性與低侵入性的Nanolive 全息斷層3D成像技術(shù)采用低功率激光，為活細(xì)胞研究提供了一個(gè)前所未有的適用工具。

Nanolive 3D顯微成像技術(shù)病毒感染及藥物研究優(yōu)勢(shì)：

﹡非侵入式或無需染色標(biāo)記；

﹡實(shí)驗(yàn)處理低于5分鐘；

﹡實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞特性；

﹡斷層掃描---96重Z軸堆疊；

﹡任意的數(shù)字染色高達(dá)9色；

﹡納米級(jí)分辨率；

﹡2秒鐘快速3D全息成像；

﹡無標(biāo)記IHC,IF組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)研究；

﹡整合3通道熒光，最高同時(shí)10色標(biāo)記，完整活細(xì)胞解決方案；