浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院蔡秀軍教授在腹部外科、肝膽胰外科、微創(chuàng)外科、移植外科等研究方面有豐富的經(jīng)驗(yàn)，近期其團(tuán)隊(duì)利用Arraystar circRNA芯片研究了肝細(xì)胞癌（HCC）中雄激素受體（AR）對(duì)circRNA表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)AR可以結(jié)合到RNA編輯酶ADAR1的啟動(dòng)子區(qū)上調(diào)ADAR1 p110的轉(zhuǎn)錄，從而抑制circRNA的表達(dá)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)ADAR1高表達(dá)的HCC患者預(yù)后不良并且與AR表達(dá)正相關(guān)。此外，circARSP91是受AR-ADAR1調(diào)控并且下調(diào)的circRNA，可以在體外和體內(nèi)抑制HCC腫瘤的生長(zhǎng)。該研究成果2017年成功發(fā)表在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊Cell Death and Disease(IF:5.965)上。（芯片實(shí)驗(yàn)由康成生物提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景 

    肝細(xì)胞癌（HCC）是由于復(fù)雜的遺傳和表觀遺傳改變而導(dǎo)致的異質(zhì)性惡性腫瘤，是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。HCC的特點(diǎn)是具有明顯的性別差異，但其機(jī)制尚不明確。雄激素受體（AR）在HCC發(fā)生和發(fā)展過程中性別差異的作用已有文獻(xiàn)報(bào)道。另外，環(huán)狀RNA（circRNA）是一類新的非編碼RNA分子，通過多種機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)功能以及影響癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展。作用于RNA的腺苷脫氨酶ADAR1可以通過中斷RNA編輯促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)有報(bào)道ADAR1是circRNA形成的關(guān)鍵調(diào)控分子。然而，由RNA編輯酶調(diào)控的circRNA在HCC中的潛在功能和分子機(jī)制至今仍然知之甚少。 

    本研究的目的就是通過circRNA芯片研究HCC中AR通過RNA編輯酶ADAR1抑制circRNA的表達(dá)，從而影響HCC，并通過一系列功能機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究該調(diào)控的作用機(jī)制。 

研究思路

    為了研究HCC中AR對(duì)circRNA表達(dá)的影響，首先作者通過qRT-PCR檢測(cè)了一些已經(jīng)報(bào)道的宿主基因不受AR調(diào)控的circRNA，發(fā)現(xiàn)AR過表達(dá)或者敲除后circRNA表達(dá)發(fā)生下調(diào)或者上調(diào)。然后作者通過Arraystar circRNA芯片對(duì)AR高表達(dá)的HCC細(xì)胞系和AR敲除后的HCC細(xì)胞系中的circRNA表達(dá)譜進(jìn)行了研究，篩選發(fā)現(xiàn)AR敲除后上調(diào)的有331個(gè)，遠(yuǎn)高于下調(diào)的177個(gè)，同時(shí)上調(diào)的差異倍數(shù)也大于下調(diào)的差異倍數(shù)。這些結(jié)果表明AR可以抑制HCC中circRNA的表達(dá)。 

    接下來(lái)作者通過qRT-PCR以及WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AR可以上調(diào)RNA編輯酶ADAR1 p110 mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)ADAR1敲除后可以恢復(fù)被AR抑制的circRNA的表達(dá)。隨后通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)以及WB和免疫組化分析發(fā)現(xiàn)ADAR1在HCC中表達(dá)上調(diào)并與AR正相關(guān)，另外，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)HCC患者中circRNA表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明AR可以通過上調(diào)ADAR1 p110抑制HCC中circRNA的表達(dá)。同時(shí)KM曲線分析表明ADAR1高表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良并且較易復(fù)發(fā)和進(jìn)展。接下來(lái)，作者通過生信分析、ChIP及熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)AR能夠結(jié)合在ADAR1 p110啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)而激活其轉(zhuǎn)錄。 

    最后作者對(duì)AR敲除后表達(dá)升高5倍以上并且來(lái)自于同一個(gè)基因PABPC1的5個(gè)circRNA進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)源于9號(hào)外顯子的circARSP91能抗RNase R消化，隨后研究發(fā)現(xiàn)AR通過ADAR抑制其表達(dá)。集落形成實(shí)驗(yàn)、MTT及裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明circARSP91能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。 

技術(shù)路線 

結(jié)果展示 
 

 
圖一、A：Arraystar circRNA芯片篩選的聚類圖；B：Arraystar circRNA芯片篩選的散點(diǎn)圖；C：qRT-PCR表明AR抑制circRNAs的表達(dá)。 
 

 
圖二、A ：ChIP表明AR可以結(jié)合到ADAR1啟動(dòng)子區(qū)；B：熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明AR可以促進(jìn)ADAR1在HCC中高表達(dá)；C：qRTPCR表明ADAR1敲除可以恢復(fù)被AR抑制的circRNA表達(dá)。 

圖三、A：circARSP91來(lái)源于PABC1第9號(hào)外顯子，對(duì)RnaseR有抗性；B：qRTPCR及WB表明circARSP91可以被AR-ADAR1抑制；C：裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明circARSP91可以抑制HCC腫瘤發(fā)展；D：AR通過結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)上調(diào)ADAR1表達(dá)抑制circRNA的表達(dá)影響HCC的發(fā)生發(fā)展的模式圖。

研究意義 

    本研究結(jié)果表明了HCC中circRNA表達(dá)模式的一個(gè)新特征，即AR可以通過結(jié)合到ADAR1 的啟動(dòng)子區(qū)上調(diào)ADAR1 p110的表達(dá)，從而抑制circRNA表達(dá)，影響HCC的發(fā)生發(fā)展。circRNA的這種表達(dá)模式有助于從新的角度解釋HCC明顯的性別差異。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)了一種新的環(huán)狀RNA circARSP91，可以在體外和體內(nèi)有效抑制HCC腫瘤形成，有助于更好地了解circRNA在HCC發(fā)生和發(fā)展過程中的作用，這也為通過circRNA尋找HCC的新型治療奠定了基礎(chǔ)。 

原文出處 

    Circular RNA expression is suppressed by androgen receptor (AR)-regulated adenosine deaminase that acts on RNA (ADAR1) in human hepatocellular carcinoma. Cell Death and Disease. 2017.