Y迷宮、morris水迷宮-SB-271046SB-271046對匹羅卡品致癇大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響
SB-271046對匹羅卡品致癇大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響

摘要:

目的：觀察5-羥色胺6受體拮抗劑SB-271046對匹羅卡品致病大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的作用效應(yīng)。

方法：成年雄性SD大鼠分為兩組:空白對照組,氯化鋰-匹羅卡品組。首先根據(jù)注射氯化鋰-匹羅卡品后是否出現(xiàn)癲病持續(xù)狀態(tài)，出現(xiàn)癲病者納入實驗，未出現(xiàn)癲病和死亡者則剔除;然后再隨機(jī)分為3組:模型組即側(cè)腦室注射羥丙基-環(huán)糊精;藥物組按不同劑量分為2組，即側(cè)腦室注射SB-271047劑量為10 ug,4ul和側(cè)腦室注射SB-271046劑量為20ug, 4ul。

結(jié)果：在Y迷宮自主交替行為實驗中，模型組自主交替率顯著下降(P<0. 01}，藥物組顯著提高尤其是20ug；劑量組(P < 0. 05)。在Y迷宮新奇事物探索實驗中，模型組的新臂時間比顯著下降(P < 0. 01)，藥物組有提高趨勢(P >0.05)。在Morris水迷宮定位航行實驗中，模型組平均潛伏期延長顯著延長(P <0.01），藥物組明顯縮短尤其是20ug劑量組(P < 0. 05)。在Morris水迷宮空間探索實驗中，模型組平均潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，原平臺象限停留時間縮短(P < 0.05），藥物組有改善趨勢(P > 0.05)。

結(jié)論：SB-271046可以改善癲病大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶，主要作用于記憶獲得鞏固階段，20ug劑量作用明顯。

關(guān)鍵詞:癲病;5 -HT6受體;SB-271046;Morris水迷宮;Y迷宮

   癲癇患者合并認(rèn)知功能障礙越來越得到人們的關(guān)注，不論是在臨床研究還是動物模型研究中都有大量的報道。目前研究表明5-HT與癲癇關(guān)系密切，其可能通過受體起作用。大量的研究表明5-HT6 R拮抗劑可以改善認(rèn)知功能，有些5-HT6 R拮抗劑已經(jīng)作為治療阿爾茨海默病AD的藥物。然而這些相關(guān)研究大部分都是在癡呆模型上進(jìn)行的，在癲癇模型上的學(xué)習(xí)記憶相關(guān)研究目前國內(nèi)外較少報道。因此我們通過建立匹羅卡品慢性癲癇模型，然后側(cè)腦室注射5-HT6 R拮抗劑SB-271046 (10ug；20 ug)。最后予Y迷宮、Morris水迷宮來檢測SB-271046對癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，為臨床上癲癇患者的學(xué)習(xí)記憶障礙的治療提供新的思路。

1材料與方法

1. 1化學(xué)藥品及實驗儀器  氯化鋰(Sigma公司)，匹羅卡品(Sigma公司)，10%羥丙基書環(huán)糊精(溶解SB-271046用，Sigma公司)，SB-271046 ( Tocris公司)，腦立體定位儀(上海欣軟信息科技有限公司)、Y迷宮、Morris水迷宮系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.2實驗動物分組 清潔級雄性SD成年大鼠，由中科院斯萊克實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK（滬）:2007-0005。大鼠體重200-250g} 10-13 w齡，12 h光照，12 h黑暗，自由攝取水和食物。動物房溫度保持在22一26℃。實驗動物按照隨機(jī)法首先分為2組:空白對照組(Vehicle) 10只，匹羅卡品組(PILO) 40只;然后根據(jù)腹腔注射PI-LO后是否出現(xiàn)四級及四級以上發(fā)作(Racine分級)，未達(dá)到者予以剔除，達(dá)到者納入實驗;;4 w后再將存活的PILO組按照隨機(jī)數(shù)字表分為:模型組(HP-CD)即側(cè)腦室注射HP-CD4ul組;10ug -SB組即側(cè)腦室注射SB 271047劑量為10ug，4ul;20ug-SB組即側(cè)腦室注射SB 271046劑量為20 ug，4ul。

1.3 LiC1-PILO癲癇動物模型建立  于腹腔注射氯化鋰(LiCl) 127 mg/kg，16-18 h后腹腔注射PILO 30 mg/kg，在給藥PILO前30 min，腹腔注射阿托品1 mg/kg，以緩解PILO的外周膽堿能效應(yīng)。連續(xù)觀察30 min，根據(jù)Racine分級，發(fā)作級數(shù)達(dá)到四級及四級以上并持續(xù)30 min以上的即造模成功。不成功者按照原劑量每30 min追加1次，追加3次仍不成功者，剔除。造模成功的大鼠60 min后，予以地西伴10 mg/kg解痙，解痙效果不佳者按原劑量每60 min追加一次。存活大鼠腹腔注射平衡葡萄糖鹽水5 ml/只，2次//d，連續(xù)3d，同時予以流質(zhì)飲食。

1.4側(cè)腦室注射5-HT6R拮抗劑SB-271046 大鼠造模成功后4 w，予10%水合氯醛深度麻醉，在腦立體定位儀幫助下，按照Watson《大鼠腦立體定位圖譜》，側(cè)腦室(前囪后0. 8 mm，旁開1.5 mm,深度4 mm)注射藥物。HP-CD組注入10% HP-P-CD4ul；10ug-SB組注入SB 271046，2.5 ug/ul，4ul;20ug- SB組注入SB 271046 ，5ug/ul，4ul。注射時間維持4 min，速度1ul/ min。手術(shù)后恢復(fù)1 w。

1.5  Y迷宮、Morris水迷宮測評 造模成功后6w進(jìn)行Y迷宮、Morris水迷宮實驗，檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶。

    Y迷宮裝置是由3個等長的黑色臂和一個中間區(qū)域組成，各臂互成120度，臂長50 cm，寬10 cm，高20 cm，支架高50 cm。動物放入后，采用Supermaze軟件采集圖像和分析數(shù)據(jù)。Y迷宮為時2 d，方法學(xué)按Robert，Dellu等的描述。1d為自主交替實驗，每只大鼠從同一個臂即起始臂放入，連續(xù)自主交替8 min，檢測自主交替自主交替率。每只大鼠結(jié)束后放回籠子，在進(jìn)行下一只實驗時，用75 %的酒精消除Y迷宮臂內(nèi)的氣味。交替率%=交替次數(shù)/(總次數(shù)-2)%。2d為新奇事物探索實驗，采用4h間隔，先隨機(jī)封閉一個臂，讓大鼠在剩余的兩個臂中自由探索10 min，4 h后打開擋板，每只大鼠自由探索5 min，記錄大鼠進(jìn)入各臂的次數(shù)和時間，尤其是新臂的次數(shù)和時間。每只大鼠結(jié)束后放回籠子，進(jìn)行下一只前同樣用75%酒精消除氣味影響。

    Y迷宮實驗結(jié)束后2 d進(jìn)行Morris水迷宮實驗。水迷宮方法學(xué)按照Charles等描述的方法。實驗總共歷行6 d。1-5 d為定位航行實驗，每只大鼠每天進(jìn)行4個象限，記錄在120 s內(nèi)找到平臺的時間(逃避潛伏期)、速度、路程等;6 d撤離平臺，記錄大鼠 120 s內(nèi)在目標(biāo)象限(原平臺所在象限)停留的時間、穿越平臺(原平臺所在位置)次數(shù)等。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 Y迷宮、Morris水迷宮實驗所有數(shù)據(jù)以X+s表示，統(tǒng)計均采用SPSS 21. 0軟件進(jìn)行，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。各組間均數(shù)如符合正態(tài)性分布及方差齊性檢驗的，均采用單因素方差分析，各組間多重比較采用Tukey's檢驗;不滿足正態(tài)性分布而方差齊性時，采用Welsh檢驗，多重比較采用Tukey ' s檢驗;二者均不滿足時采用非參數(shù)Kruskal Wallis檢驗，各組間多重比較采用Nemenyi法檢驗。

2結(jié)果

    2. 1實驗大鼠存活 Vehicle組10只大鼠全部存活。造模組40只大鼠，注射PILO后成功出現(xiàn)四級及四級以上并持續(xù)30 min的有34只，6只再追加3次后仍失敗，剔除。成功率為85 %。由于急性期大鼠易死亡，但2 w后大鼠基本穩(wěn)定，死亡率大大下降，故在2 w后統(tǒng)計成功SE的大鼠，存活24只，死亡10只，死亡率29.4%。4 w后進(jìn)行側(cè)腦室給藥，至6w后行為學(xué)實驗時，HP-CD組、10ug- SB組和20ug -SB組各死亡2只。故最后行為學(xué)的大鼠共28只，Vehicle組10只，HP}D組6只，10ug- SB組6只，20ug- SB組6只。

2. 2  Y迷宮測評

2. 2. 1   Y迷宮自主交替行為實驗，檢測在8min內(nèi)各組大鼠的自發(fā)性交替率，見圖1

2. 2. 2  Y迷宮新奇事物探索實驗，檢測各組大鼠在各臂的時間，尤其是新臂的時間。 

2.3   Morris水迷宮測評

2.3.1   Morris水迷宮定位航行實驗中，連續(xù)進(jìn)行5d，測定大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的獲取階段的學(xué)習(xí)能力，主要測定大鼠找到隱蔽平臺的潛伏期。

3討論

    臨床上癲癇患者的記憶損害的類型多樣，如言語性記憶，片段性記憶，空間記憶等;同樣，在PILO癲癇動物模型上也有類似發(fā)現(xiàn)。研究表明Y迷宮自主交替實驗可以檢測動物空間工作記憶，Y迷宮新奇事物探索的場地再認(rèn)實驗可檢測片段式記憶，水迷宮實驗可檢測空間參照記憶和空間工作記憶。因此本實驗建立LiCl-PILO癲癰模型，采用Y迷宮和水迷宮來研究癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶是合理的。在連續(xù)8min的Y迷宮SAB中，HP-CD組其自主交替率顯著下降，提示其學(xué)習(xí)記憶能力的嚴(yán)重受損，可見癲癇大鼠其學(xué)習(xí)能力下降，這與臨床上癲癇患者空間學(xué)習(xí)記憶和短時記憶受損表現(xiàn)是一致的;藥物組提高，尤其是20ug劑量，提示藥物具有改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。在Y迷宮新奇事物探索4h間隔的實驗中，在Vehicle組其新臂時間明顯延長，而且大于隨機(jī)概率33. 33%，提示其學(xué)習(xí)提取再現(xiàn)能力是正常的;而HP-CD組卻明顯縮短，并且與隨機(jī)交替率33. 33%相比，明顯下降(P <0. 05，表現(xiàn)出不能識別新臂，提示其學(xué)習(xí)記憶的提取再現(xiàn)能力嚴(yán)重受損。4組的新臂時間比較，發(fā)現(xiàn)HP-CD組明顯下降為26. 15%，可見癲癇大鼠空間記憶能力受損，尤其是記憶提取再現(xiàn)過程受損;而藥物組新臂時間是延長的，盡管未達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義，這可能提示5-HT6受體拮抗主要作用于記憶的獲得階段而非提取再現(xiàn)階段。這與Costa等的結(jié)果一致。他們發(fā)現(xiàn)5-HT6R拮抗劑可以改善年輕成年鼠的記憶獲得鞏固階段，并可逆轉(zhuǎn)老年鼠因年老而造成的記憶鞏固能力的缺陷。

在Morris水迷宮定位航行實驗中，大鼠在每天4次的實驗中，幾乎都是第1次的潛伏期最長，而后逐漸縮短，而且隨著天數(shù)增加，每天的平均潛伏期也是不斷縮短的，尤其是Vehicle組和20ug -SB組，其5d的平均潛伏期明顯縮短(P < 0.05)。這就提示了Vehicle組和藥物20ug組的大鼠其學(xué)習(xí)記憶能力是良好的，能形成對平臺位置的長期記憶并能提取儲存的空間記憶。HP-CD組的大鼠在2d-5d的試驗中，其每天4次的試驗的潛伏期無明顯的變化，并且5d平均潛伏期改變未達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義，這就提示了HP-CD組大鼠對平臺位置不能形成長期記憶或者提取存儲的空間記憶受損。10 ug -SB組5d的平均潛伏期也是逐漸縮短的，盡管未達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義，提示其改善作用不明顯�？傮w上，HP}D 5 d的平均潛伏相對正常組是延長的，而藥物組可以改善其表現(xiàn)，尤其是20ug劑量組(P<0.05)，提示可能存在劑量依賴性。這與Foley等的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)SB-271046可以改善大鼠在Morris水迷宮的表現(xiàn)，可改善空間記憶的獲得階段。Morris水迷宮6d的空間探索實驗中，HP-CD組其潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)明顯減少，在原平臺象限停留時間明顯減少，表明了其學(xué)習(xí)記憶提取再現(xiàn)能力的受損，與Inostroza等的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)LiC1-PIL0癲癇模型的大鼠在空間學(xué)習(xí)記憶的獲得和維持能力明顯受損。藥物組盡管還尚達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義，但具有明顯改善的趨勢，提示藥物在記憶提取再現(xiàn)階段的作用不強(qiáng)，與King等結(jié)果大體一致。

    綜上，我們的實驗結(jié)論是5-HT6R拮抗劑SB-27046可以改善癲癰大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，尤其是作用于記憶獲得鞏固階段，可能具有一定的劑量依賴，其改善學(xué)習(xí)記憶的作用機(jī)制目前國內(nèi)外包括我們課題組正在進(jìn)行研究，如我們正在進(jìn)一步深入研究5 -HTR6受體介導(dǎo)mTOR通路在慢性癲癰模型的學(xué)習(xí)記憶等相關(guān)方面的分子學(xué)機(jī)制，為臨床上癲癇合并認(rèn)知功能障礙的患者的治療提供新思路。