中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院院長、主任醫(yī)師徐瑞華教授長期從事消化道腫瘤個體化治療領(lǐng)域及抗癌藥物研究，在消化道腫瘤的轉(zhuǎn)移與轉(zhuǎn)歸、化療藥物耐受及其機(jī)制和優(yōu)化臨床治療方面具有國際領(lǐng)先的創(chuàng)新性成果。近期，該課題組應(yīng)用Arraystar lncRNA芯片在肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中分析了lncRNAs的表達(dá)情況。課題組篩選到與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)的lncRNA UICLM，并闡明了lncRNA UICLM在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中的功能和調(diào)控機(jī)制。該研究成果于2017年發(fā)表在國際著名學(xué)術(shù)期刊Theranostics（IF = 8.766）上。（芯片實(shí)驗(yàn)由康成生物提供技術(shù)服務(wù)）

研究背景
    結(jié)直腸癌（CRC）是世界上第二大常見和第三大引起死亡的惡性腫瘤疾病。盡管近年來CRC的治療已取得了巨大的進(jìn)展，但是效果還不盡人意。CRC晚期會發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，其中最常見的是肝轉(zhuǎn)移。肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后非常差，生存率很低。長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）是一類長度大于200nt的轉(zhuǎn)錄本，lncRNAs的異常表達(dá)和癌癥的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系，如HOTAIR、MALAT1和H19等在癌癥的發(fā)生中扮演著重要的角色。雖然已經(jīng)有越來越多的lncRNAs被挖掘和注釋，但是lncRNAs在CRC肝轉(zhuǎn)移中的功能和分子調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚。
    本研究通過lncRNA芯片篩選出與CRC肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNAs，并通過大量的功能實(shí)驗(yàn)研究異常表達(dá)的lncRNA如何調(diào)控結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。

研究思路
    首先，作者選取了7個具有肝轉(zhuǎn)移和8個沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC組織進(jìn)行l(wèi)ncRNA芯片篩選（Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0）。作者采用FC >= 4.0和p-value < 0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選到了493個差異表達(dá)的lncRNAs，接著對上調(diào)最顯著的12個lncRNA進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證，其中有9個lncRNA在肝轉(zhuǎn)移的CRC組織中出現(xiàn)了高表達(dá)。隨后作者通過擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)lncRNA UICLM在肝轉(zhuǎn)移的CRC組織中顯著上調(diào)。

    接著，作者通過過表達(dá)和干擾實(shí)驗(yàn)探究了UICLM的生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)表明干擾UICLM會顯著抑制細(xì)胞增殖、集落形成和細(xì)胞遷移侵襲，過表達(dá)則會出現(xiàn)相反表型。免疫熒光分析以及RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示了UICLM對CRC細(xì)胞中EMT的影響。細(xì)胞注射實(shí)驗(yàn)顯示注射SW620sh-UICLM細(xì)胞的小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤的比例明顯低于注射SW620sh-NC細(xì)胞，并且肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目也顯著降低。另外，作者還發(fā)現(xiàn)UICLM可以影響結(jié)直腸癌細(xì)胞干性。

    最后作者深入研究了lncRNA UICLM調(diào)控CRC肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。lncRNA 芯片數(shù)據(jù)分析顯示UICLM與ZEB2存在正相關(guān)，IHC和RT-PCR結(jié)果顯示ZEB2 mRNA和蛋白水平在肝轉(zhuǎn)移的CRC組織中顯著過表達(dá)。RNA-seq結(jié)果也表明干擾UICLM會導(dǎo)致ZEB2的表達(dá)水平明顯下降。然后，作者通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)UICLM和ZEB2具有共同結(jié)合的miRNA——has-miR-215。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明CRC組織中miR-215的表達(dá)水平明顯下調(diào)，并且抑制miR-215會顯著增加UICLM的表達(dá)，反之，敲低UICLM顯著增加miR-215表達(dá)。最后，作者通過pull down實(shí)驗(yàn)也表明miR-215和Ago2形成沉默復(fù)合物（RISC），可以結(jié)合在lncRNA UICLM的 miRNA的結(jié)合位點(diǎn)上。也就進(jìn)一步佐證了lncRNA UICLM可以通過ceRNA機(jī)制調(diào)控靶基因ZEB2的表達(dá)。

    上述研究表明CRC組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)的lncRNA UICLM通過ceRNA機(jī)制競爭性結(jié)合miR-215來調(diào)控ZEB2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)EMT和干細(xì)胞特性，最終影響細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)CRC的肝轉(zhuǎn)移。

研究路線

結(jié)果展示

圖1芯片篩選差異lncRNA、驗(yàn)證以及臨床相關(guān)性分析

圖2 lncRNA UICLM功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示

圖3 lncRNA UICLM分子調(diào)控機(jī)制模式圖

研究意義
    作者借助Arraystar lncRNA芯片篩選出參與CRC肝轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)lncRNA UICLM，并且通過功能和機(jī)制實(shí)驗(yàn)表明了UICLM可以競爭性結(jié)合miR-215調(diào)控ZEB2表達(dá)，從而促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移發(fā)生，這對于研究結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移以及探究非編碼RNA的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

原文出處
Long non-coding RNA UICLM promotes colorectal cancer liver metastasis by acting as a ceRNA for microRNA-215 to regulate ZEB2 expression. Theranostics. 2017.