簡(jiǎn)介

在這篇應(yīng)用文獻(xiàn)中，我們展示了如何用SpectraMax®i3、SpectraMax®Paradigm®和SpectraMax®M5e多功能微孔板讀板機(jī)進(jìn)行可靠的、高通量的HTRF®檢測(cè)，并具有完美的Z’因子和高重復(fù)性的EC50值。

HTRF®是CisbioBioassays公司開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)檢測(cè)生物分子相互作用的多用途技術(shù)1。這項(xiàng)技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)和時(shí)間分辨(TR)熒光測(cè)定，可消除短壽命的背景熒光。這一檢測(cè)使用供體和受體熒光基團(tuán)。當(dāng)供體和受體彼此足夠接近時(shí)，能量源(如氙閃燈)激發(fā)供體使能量轉(zhuǎn)移到受體上，受體發(fā)射出特定波長(zhǎng)的熒光。

HTRF使用4種專門的熒光基團(tuán)，能夠組合成一對(duì)供體-受體TR-FRET基團(tuán)。供體為銪(Eu3+)的穴狀化合物和鋱(Lumi4^TM-Tb)的穴狀化合物，其長(zhǎng)壽命熒光可以用于時(shí)間分辨熒光檢測(cè)中1。兩種受體分別為XL665和d2，用于HTRF檢測(cè)中。這兩種受體的激發(fā)光譜均與HTRF供體的發(fā)射光譜重疊。每個(gè)受體的發(fā)射峰都在665nm且供體在這一范圍內(nèi)沒(méi)有發(fā)射光或發(fā)射光很弱。最初的HTRF受體XL665，是一種從紅藻中純化出的藻膽蛋白色素。第二代受體d2是一種經(jīng)過(guò)修飾的別藻藍(lán)蛋白，比XL665小100倍且可以減少可能在XL665檢測(cè)中出現(xiàn)的空間位阻問(wèn)題。

HTRF cAMP HiRange試劑盒能夠在細(xì)胞樣品中對(duì)環(huán)腺苷酸(cAMP，環(huán)腺苷3’，5’ 一磷酸)進(jìn)行定量。cAMP在G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中是一種關(guān)鍵的第二信使。當(dāng)配體結(jié)合到GPCR，構(gòu)想改變就會(huì)發(fā)生，激活受體接著激活G蛋白。進(jìn)一步的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)取決于激活的G蛋白類型。Gs的激活導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶調(diào)控cAMP的上調(diào)。細(xì)胞中產(chǎn)生的自由cAMP與d2-標(biāo)記的cAMP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗cAMP穴狀化合物抗體，因此，細(xì)胞內(nèi)cAMP的增加會(huì)導(dǎo)致FRET降低，偵測(cè)到的665nm熒光發(fā)射也會(huì)下降(圖 1)。

優(yōu)勢(shì)

- 高度可靠的均相實(shí)驗(yàn)
- Z’ 因子 ≥ 0.9
- 流程式且穩(wěn)定的高通量(HTS)檢測(cè)
- SoftMax Pro軟件預(yù)設(shè)實(shí)驗(yàn)?zāi)０蹇焖佾@得結(jié)果

材料

- cAMP HiRange 1000 測(cè)試
(Cisbio P/N 62AM6PEB)
- 黑色和白色低體積384-孔微孔板
(Greiner P/N 784076 和 784075)
- SpectraMax i3 多功能微孔板讀板機(jī)
(Molecular Devices)
- SpectraMax Paradigm 多功能微孔板
讀板機(jī)(Molecular Devices)
- SpectraMax M5e 多功能微孔板讀板機(jī)
(Molecular Devices)
- HTRF 檢測(cè)卡盒
(Molecular Devices P/N 0200-7011)

方法

HTRF cAMP HiRange試劑盒由CisbioBioassays公司提供。按照cAMP HiRangeHTRF藥品說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備終濃度范圍從0.17nM到2800 nM的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品。不含cAMP的陽(yáng)性質(zhì)控(最大FRET)和不含cAMP或cAMP-d2的陰性質(zhì)控包含在內(nèi)。按照表1中所述，每孔添加20 μL試劑。

數(shù)據(jù)分析

使用Cisbio專利的基于雙發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)的比值算法分析HTRF檢測(cè)。616nm發(fā)射波長(zhǎng)的供體作為內(nèi)參，同時(shí)665nm發(fā)射波長(zhǎng)的受體作為測(cè)定生物學(xué)反應(yīng)的指示。這種比例測(cè)定減少了孔與孔之間的差異并降低了化合物干擾。在第4步計(jì)算的Delta F反映了測(cè)定時(shí)的信號(hào)相對(duì)于背景大小，用于內(nèi)部測(cè)定的比較。結(jié)果通過(guò)665 nm/616 nm比值計(jì)算，以如下Delta F表示：

Z’ 因子由陰性(無(wú)cAMP，無(wú)cAMP-d2)和陽(yáng)性質(zhì)控(無(wú)cAMP)計(jì)算得到2。

利用SoftMax® Pro軟件生成和分析數(shù)據(jù)，包含一些預(yù)設(shè)的HTRF實(shí)驗(yàn)?zāi)０逡院?jiǎn)化檢測(cè)和分析。

結(jié)果

使用SoftMax Pro軟件的4-參數(shù)曲線擬合如上所述進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和做圖。依據(jù)表2的讀板機(jī)參數(shù)設(shè)置獲得最佳結(jié)果。當(dāng)延遲時(shí)間、整合時(shí)間和脈沖數(shù)增加，會(huì)觀察到DF%的下降。與白色微孔板(圖2)相比，使用黑色低體積384-孔微孔板可使檢測(cè)窗從3020增加到3253。然而，Z’ 因子，考慮到陽(yáng)性和陰性質(zhì)控的檢測(cè)窗和標(biāo)準(zhǔn)差以及EC 50值在兩個(gè)孔板類型中非常相似(表3)。(注意：當(dāng)使用SpectraMax M5e多功能微孔板讀板機(jī)，需要白色孔板。)

SpectraMax i3和SpectraMax Paradigm讀板機(jī)在逐一比較相同測(cè)試孔板時(shí)得到的結(jié)果基本一致(圖3)。針對(duì)這一測(cè)試，利用了白色微孔板。檢測(cè)窗為3004和3051，且Z’ 因子分別是0.92和0.90。EC50值是19.1nM，相比于發(fā)布值(表3)。SpectraMaxM5e多功能微孔板讀板機(jī)得到相似的Z’因子和EC50值。

SpectraMax Paradigm讀板機(jī)得益于雙PMT配置而比其他讀板機(jī)更快，使之可以同時(shí)讀取兩個(gè)HTRF發(fā)射波長(zhǎng)(表3)。

總結(jié)

SpectraMaxi3和SpectraMaxParadigm讀板機(jī)可配置具有高通量篩選能力且HTRF認(rèn)證的檢測(cè)卡盒。當(dāng)在SpectraMaxParadigm讀板機(jī)上使用時(shí)，此卡盒能進(jìn)行雙發(fā)射同時(shí)檢測(cè)從而加快讀數(shù)速度。在三個(gè)讀板機(jī)中，cAMPHiRange測(cè)定得到的完美Z’因子表明了多功能檢測(cè)系統(tǒng)的可靠性能。采用SoftMaxPro軟件自帶的HTRF預(yù)設(shè)實(shí)驗(yàn)?zāi)０宕蟠蠛?jiǎn)化了數(shù)據(jù)采集和分析。

參考

1. http://www.htrf.com/htrf-technology
2. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., and Oldenburg,K. R. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of highthrough put screening assays J. Biomolecular Screening4(2): 67-73.