背景/介紹

抗體（Abs），或免疫球蛋白（Ig），被廣泛用于許多不同的科研和治療性應(yīng)用¹。特別是，單克隆抗體（mAbs）在診斷、蛋白質(zhì)純化以及醫(yī)療應(yīng)用中的使用顯著增加^2-5。妨礙治療性mAbs使用的一個(gè)主要障礙是皮下注射需要使用較高的濃度，因?yàn)檫@是優(yōu)先選擇的給藥方法。按FDA要求，皮下給藥時(shí)，注射體積應(yīng)低于1.5ml，這就意味著，制劑的濃度需高于100mg/ml⁷。但是，如此高濃度的mAb制劑對(duì)生產(chǎn)來說會(huì)是不小的挑戰(zhàn)，問題包括穩(wěn)定性、溶解性、高粘度以及聚集^8,9。Ab制劑也會(huì)有相似的問題。

相比平板膜包過濾器，中空纖維切向流過濾（HF TFF）是高濃度Abs制劑制備的一種極佳的方法，因?yàn)槔w維內(nèi)腔呈現(xiàn)非湍流的流體動(dòng)力學(xué)，獲得顯著更低的壓力降。對(duì)于大多數(shù)使用膜包式TFF過濾器的高濃度Ab應(yīng)用，需降低進(jìn)樣泵，以維持恒定的壓力，因?yàn)榭贵w的粘度會(huì)不斷增加。在HF TFF中，不需要控制進(jìn)樣泵，因?yàn)閴毫υ黾臃浅Ｐ�。此外，使用HF 過濾器時(shí)，產(chǎn)物的收獲和排空也非常簡(jiǎn)單，因其沒有膜包過濾器通常使用的湍流促進(jìn)器或篩網(wǎng)。最后，使用一次性HF 過濾器可免去繁瑣的清洗、組裝、拆裝和維護(hù)步驟，最終節(jié)省傳統(tǒng)膜包過濾器使用相關(guān)的時(shí)間和間接成本。

本應(yīng)用測(cè)試了使用HF膜進(jìn)行IgG有效濃縮的可行性，并分析了剪切率和跨膜壓（TMP）對(duì)濾液通量的影響。

材料和方法

系統(tǒng)：KR2i TFF系統(tǒng)（SYR2-U20，SpectrumLabs.com）

過濾器：30kDa mPES，MicroKros（C02-E030-05-N，0.5mm；C02-E030-10-N，1.0mm，SpectrumLabs.com）

樣品準(zhǔn)備

IgG為商業(yè)化產(chǎn)品（Sigma Aldrich），溶解于0.9%鹽溶液，至終濃度30mg/mL。實(shí)驗(yàn)運(yùn)行前，溶液使用0.2μm過濾器過濾，去除較大的顆粒。

IgG起始和終濃度使用280nm吸光光度法檢測(cè)，使用Beer法則計(jì)算濃度。ε280=210,000M^-1cm^-1。

過濾器組件準(zhǔn)備

濃縮實(shí)驗(yàn)前，過濾器組件潤(rùn)濕，并測(cè)試完整性。MicroKros過濾器組件截留分子量（MWCO）為30kDa，含改性聚醚砜（mPES）纖維，在本應(yīng)用筆記中，實(shí)驗(yàn)使用纖維內(nèi)徑（ID）為0.5mm（每根組件含6根纖維，20cm²）或1.0mm（每根組件含2根纖維，13cm²）的組件。組件潤(rùn)濕及完整性測(cè)試使用KR2i TFF系統(tǒng)進(jìn)行。簡(jiǎn)單來說，過濾器組件用DI水沖洗，直至每cm2表面積濾液體積為2ml。使用泄漏實(shí)驗(yàn)，測(cè)試?yán)w維和組件完整性。組件完全潤(rùn)濕，纖維外腔（ECS）用水完全浸沒�；亓鞫岁P(guān)閉，通過入口，向組件內(nèi)緩慢導(dǎo)入空氣。當(dāng)跨膜壓（TMP）達(dá)到~0.5psi時(shí)，停泵。ECS內(nèi)無氣泡，且進(jìn)樣壓力恒定，說明為完整過濾器組件。完整性檢查后，使用0.9%鹽溶液潤(rùn)洗過濾器，直到收集到2mL/cm²的濾液。

濃縮實(shí)驗(yàn)

濃縮實(shí)驗(yàn)使用KR2i TFF系統(tǒng)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)使用纖維內(nèi)徑0.5和1.0mm的HF膜，剪切為6,000S^-1。使用整合式KF Comm軟件采集數(shù)據(jù)（流速、壓力等）。IgG溶液（30mg/mL）加入錐底容器（含3導(dǎo)管蓋，SpectrumLabs.com）。濾液管路連接至收集容器。濃縮過程通過測(cè)量收集的濾液的質(zhì)量來監(jiān)測(cè)，由KF Comm軟件自動(dòng)檢測(cè)。在3秒鐘內(nèi)，緩慢增加泵速，至所需流速（6,000S^-1剪切），將蛋白溶液泵入組件。KR2i系統(tǒng)設(shè)置為濃縮（C）模式。

剪切率實(shí)驗(yàn)

為測(cè)試不同剪切率對(duì)濾液通量的影響，將IgG溶液（~100mg/mL）循環(huán)通過HF膜。為保證整個(gè)工藝過程中，IgG濃度恒定，IgG溶液用0.9%鹽溶液連續(xù)洗濾。系統(tǒng)設(shè)置與C模式一致，但將錐底樣品容器的第3根導(dǎo)管連接至裝有緩沖液的輔助容器，而不是連通空氣。流路通過工藝過程中形成的真空，向IgG溶液中連續(xù)添加緩沖液，速度與濾液流速一致。剪切率實(shí)驗(yàn)以可提供適當(dāng)剪切率的流速進(jìn)行，不施加背壓。實(shí)驗(yàn)使用含0.5和1.0mm內(nèi)徑HF膜的過濾器組件進(jìn)行，數(shù)據(jù)采集使用KF Comm軟件。

跨膜壓（TMP）實(shí)驗(yàn)

通過在恒定剪切率條件下，向回流管路施加背壓，測(cè)試跨膜壓（TMP）對(duì)過濾器性能的影響。實(shí)驗(yàn)使用含0.5和1.0mm內(nèi)徑HF膜的MicroKros過濾器組件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)使用剪切率6,000和10,000S^-1。實(shí)驗(yàn)設(shè)置與剪切率實(shí)驗(yàn)相似，只有一個(gè)需要注明的不同。按濃縮/洗濾（C/D）模式，使用一個(gè)二級(jí)洗濾泵向蛋白溶液中連續(xù)補(bǔ)加緩沖液（0.9%鹽），以在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，維持恒定的30mg/mL的IgG濃度（濃縮因子設(shè)置為1，以使洗濾立即開始）。數(shù)據(jù)使用KF Comm軟件采集。

結(jié)果和討論

濃縮實(shí)驗(yàn)（0.5mm內(nèi)徑）

起始實(shí)驗(yàn)中，我們使用HF膜測(cè)試了IgG可被濃縮的最大限度。使用含0.5mm內(nèi)徑纖維的MicroKros組件。實(shí)驗(yàn)中，將20mL 30mg/mL的IgG溶液（0.9%鹽溶液）置于50mL含3導(dǎo)管蓋的錐底工藝容器中。2根導(dǎo)管分別連接至組件的進(jìn)樣和回流管路，第3根導(dǎo)管連通空氣。

濾液管路關(guān)閉，IgG溶液緩慢泵入管路和組件。當(dāng)循環(huán)流速恒定后，打開濾液管路，開始濃縮。在此實(shí)驗(yàn)中，不施加外部背壓（通過回流管路），所以，隨溶液濃度增加而導(dǎo)致的粘度的增加，TMP增加。進(jìn)樣流速27mL/min（6,000S^-1剪切）也保持恒定。

圖1.使用含0.5mmID mPES HF 膜的MicroKros組件進(jìn)行高度濃縮實(shí)驗(yàn)時(shí)的通量、TMP、壓力降（DP）和濃縮因子（CF）數(shù)據(jù)。

如圖1所示，濃縮開始后，TMP立即開始增加。同時(shí)，通量開始穩(wěn)定下降。組件兩端的壓力降（DP）可作為膜污染的指示，通常是涉及濃縮步驟的工藝的困擾。但是，圖1顯示，即使在工藝開始60min后，壓力降維持在10psig以下。60min之后，壓力降開始增加超過10psig，最終達(dá)到約25psig，通量降至0L/m²/hr。

使用UV-分光光度法確定IgG溶液的最終濃度，約為350mg/mL，相當(dāng)于濃縮~12x。

濃縮實(shí)驗(yàn)（1.0mm內(nèi)徑）

我們也使用含1.0mm纖維內(nèi)徑HF膜的過濾器組件進(jìn)行了濃縮實(shí)驗(yàn)。該工藝的剪切率保持恒定，為6,000S^-1（71mL/min。）TMP通過自動(dòng)背壓閥控制，維持為5psig。結(jié)果如圖2所示。

圖2. 使用含1.0mm ID mPES HF膜的MicroKros組件進(jìn)行濃縮運(yùn)行時(shí)的通量、TMP、DP和CF數(shù)據(jù)。運(yùn)行過程中TMP保持恒定為5psig（除最后數(shù)據(jù)點(diǎn)）。

如圖2所示，1.0mm內(nèi)徑纖維的起始通量高于0.5mm內(nèi)徑纖維（18L/m²/hr vs. 12L/m²/hr）。正如預(yù)期，通量隨IgG溶液濃度的增加而降低。運(yùn)行過程中，TMP恒定為5psig，直到接近運(yùn)行結(jié)束時(shí)，增加至約10psig。此時(shí)，通量降低至0L/m²/hr。圖2同時(shí)顯示，在整個(gè)運(yùn)行過程中，總壓力降低于8psig，說明膜污染較低。這表明，1.0mm纖維在濃縮過程中，可獲得更好的過濾器通量。

使用UV分光光度法檢測(cè)IgG終溶液的濃度，計(jì)算為約226mg/mL，濃縮7.5倍。使用1.0mm內(nèi)徑纖維需要使用更大的管路，以達(dá)到71mL/min的流速。由于滯留體積的增加，不能獲得高于250mg/mL的濃度。但是，在優(yōu)化的條件下，可獲得更高的濃度。

剪切率實(shí)驗(yàn)

由于使用HF膜進(jìn)行IgG濃縮時(shí)的壓力降更低，所以可使用更高的進(jìn)樣流速/剪切率，縮短處理時(shí)間。為檢測(cè)剪切率對(duì)濾液流速的影響，將IgG溶液（~100mg/mL）在逐步增加的進(jìn)樣流速/剪切率條件下循環(huán)。實(shí)驗(yàn)運(yùn)行不施加背壓。

對(duì)0.5mm（圖3）和1.0mm（圖4）纖維，提高剪切率，可增加濾液通量。如圖3所示，濾液通量隨剪切率提高而線性增加，剪切率從4,000S^-1升至12,000S^-1時(shí)，通量分別從6L/m²/hr增加至10L/m²/hr。但是，需要注意的是，即使不施加背壓，在最低剪切率條件下（4,000S^-1），最低TMP仍有5psig。當(dāng)剪切率增加至12,000S^-1時(shí)，TMP增加至約20psig。

與0.5mm內(nèi)徑HF膜，1.0mm內(nèi)徑HF膜過濾器組件顯示濾液通量顯著增加，同時(shí)跨膜壓有較大降低。圖4顯示，濾液通量增加4倍，從4L/m²/hr增加至16L/m²/hr。重要的是，跨膜壓基本保持不變，即使在11,000S^-1剪切率時(shí)，也不會(huì)增加超過5psig。而在TMP 為5psig時(shí)，0.5mm內(nèi)徑纖維只能獲得約6L/m²/hr的濾液通量。

圖4. 使用1.0mm ID HF膜時(shí)，提高剪切率對(duì)濾液通量的影響。

TMP實(shí)驗(yàn)

在我們最后的實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了在給定剪切率條件下，施加背壓對(duì)過濾器性能的影響。在此實(shí)驗(yàn)中，在6,000和10,000S^-1剪切率條件下，對(duì)含有0.5和1.0mm內(nèi)徑纖維的過濾器組件進(jìn)行測(cè)試，而TMP從5增加至20psig。結(jié)果如圖5和圖6所示。實(shí)驗(yàn)使用30mg/mL IgG溶液（0.9%鹽溶液）進(jìn)行。

如圖5所示，增加背壓對(duì)濾液通量會(huì)有負(fù)作用，使用含0.5mm內(nèi)徑纖維過濾組件，剪切率為6,000S^-1時(shí)，通量從14L/m²/hr降低至9L/m²/hr。這說明提高背壓會(huì)增加凝膠層的形成，最終降低過濾器性能。有意思的是，當(dāng)剪切率增加至10,000S^-1，且TMP恢復(fù)至5psig，濾液通量增加至18L/m²/hr，這說明增加的流速可從膜表面清掃并去除沉降的IgG。此外，將TMP增加至10、15和20psig，對(duì)濾液通量不會(huì)有不利的影響，說明在10,000S^-1下，增加的剪切率可有效且連續(xù)地沖掃膜表面。而即使在較高的TMP條件下，這種沖掃作用防止了凝膠層的形成。

圖5.通過背壓提高TMP時(shí)，對(duì)0.5mm內(nèi)徑HF膜的影響。

圖6所示為使用含1.0mm內(nèi)徑纖維過濾器組件時(shí)，進(jìn)行的一致的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果�？梢姡�在剪切6,000或10,000S-¹時(shí)，濾液通量不會(huì)隨TMP的增加而降低。在所有測(cè)試的TMP條件下，剪切率為6,000S^-1時(shí)，通量維持約為15L/m²/hr。剪切率為10,000S^-1時(shí)，當(dāng)TMP從5增加至20psig，通量從20稍微提高至23L/m²/hr。

圖6. 通過背壓提高TMP時(shí)，對(duì)1.0mm內(nèi)徑HF膜的影響。

總結(jié)

這里，我們描述了使用含0.5和1.0mm內(nèi)徑纖維的HF 過濾器組件進(jìn)行IgG濃縮的工藝。本應(yīng)用筆記顯示，使用Spectrumlabs.com的HF膜，IgG濃度可濃縮至350mg/mL。此外，我們發(fā)現(xiàn)，0.5和1.0mm內(nèi)徑膜在此實(shí)驗(yàn)中，存在性能差異。

這些實(shí)驗(yàn)顯示，含1.0mm內(nèi)徑纖維的過濾器組件更適合Abs的濃縮。使用1.0mm內(nèi)徑纖維可獲得更低的壓力降和更高的通量，從而縮短處理時(shí)間。

同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)工藝施加背壓不會(huì)顯著提高濾液通量。在某些情況下，背壓會(huì)降低濾液通量。當(dāng)然，每一個(gè)工藝都需要其自身的一系列實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化參數(shù)，但這些結(jié)果可作為一個(gè)良好的起始點(diǎn)（如6,000-8,000S^-1，不施加背壓）。

總結(jié)來說，使用SpectrumLabs.com的HF膜，可快速、溫和、穩(wěn)定地獲得高Ab濃度，從根本上降低產(chǎn)物損失。此外，由于HF過濾器組件的幾何結(jié)構(gòu)和排空能力，產(chǎn)物隔離保持在較高水平，進(jìn)一步提高了產(chǎn)物的收率。綜合這些IgG實(shí)驗(yàn)結(jié)果，相似的工藝可用于mAbs的純化。

參考文獻(xiàn)：

1. Lipman,N.S.; Jackson, L.R.; Trudel,L.J.; Weis-Garcia, F.ILAR Journal 2005,46,258.
2. Weiner,L.M.; Surana,R.; Wang,S. Nat Rev Immunol 2010,10,317.
3. Weiner,G.J. Nat Rev Cancer 2015,15,361.
4. Levy,N.E.; Valente,K.N.; Choe,L.H.; Lee,K.H.; Lenhoff,A.M. Biotechnology and Bioengineering 2014,111,904.
5. Ecker,D.M.; Jones,S.D.; Levine,H.L. mAbs 2015,7,9.
6. Shire,S.J.; Shahrokh,Z.; Liu,J. Journal of Pharmaceutical Sciences,93,1390.
7. Neergaard,M.S.; Nielsen,A.D.; Parshad,H.; De Weert,M.V. Journal of Pharmaceutical Sciences 2014,103,115.
8. Shire,S.J.; In Monoclonal Antibodies; Woodhead Publishing: 2015 p93.
9. Shire,S.J.; In Monocolnal Antibodies; Woodhead Publishing: 2015 p139.

掃描二維碼，關(guān)注仕必純微信公眾號(hào)，獲取更多應(yīng)用信息！