毛冬青改善血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶作用的研究

摘要:

目的:觀察毛冬青提取物對血管性癡呆(V D)模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討其潛在的作用機(jī)制。

方法:采用反復(fù)夾閉、再通雙側(cè)頸總動脈同時(shí)尾靜脈放血的方法制備小鼠癡呆模型，隨后將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，尼莫地平對照組(30mg/kg)，毛冬青低、中、高劑量組(5,  10,  20 g/kg)，各組灌胃相應(yīng)藥物10 mL/kg，連續(xù)35 d，從第30天開始進(jìn)行行為學(xué)檢測，末次給藥后收集大腦樣本，HE染色觀察病理學(xué)變化、免疫組化法及W esten Blot法檢測Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的恐懼記憶時(shí)間明顯縮短，大腦海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞病變嚴(yán)重，海馬區(qū)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的比值降低，且主要分布于胞質(zhì)。與模型組比較，各藥物組小鼠的恐懼記憶時(shí)間明顯延長，大腦海馬區(qū)的組織病變情況改善，且海馬區(qū)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的比值顯著增加。

結(jié)論:毛冬青提取物可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)B ax蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，從而改善血管性癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

關(guān)鍵詞:毛冬青提取物;血管性癡呆;學(xué)習(xí)記憶能力;細(xì)胞凋亡

    隨著全球老齡化的出現(xiàn)，慢性疾病癡呆越來越引起人們的關(guān)注。其中，血管性癡呆是繼阿爾茨海默病之后誘發(fā)老年期癡呆的第二大病因Czl，也是目前唯一可以預(yù)防的腦退化疾病類型。因此，研發(fā)有效預(yù)防及治療VD的藥物具有重要的意義。毛冬青為冬青科冬青屬植物毛冬青的干燥根或葉，是我國南方常用中藥，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒等功效，大量研究表明，毛冬青的各類制劑對冠心病、腦血栓、血栓性脈管炎等心腦血管疾病均有顯著療效。本研究通過觀察毛冬青提取物對血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬區(qū)病理變化及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討毛冬青改善血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶的可能作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治VD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物KM種小鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量32一35 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號:SCXK(粵)2013-0002。實(shí)驗(yàn)動物喂養(yǎng)環(huán)境:溫度23一25℃;相對濕度(50士5)%，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

1.2藥物及主要試劑 毛冬青飲片分別購于康美藥業(yè)股份有限公司和廣州大翔藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃海波教授鑒定為毛冬青植物Ilex pubescens Hook. et. Arn.。取毛冬青飲片300g，粉碎成粗粉，加入60%乙醇加熱回流提取2次，依次用6倍量和4倍量溶媒分別提取1.5 h和1 h,濾過后合并藥液，減壓濃縮至150 m L，即得PHRE儲備液，用時(shí)以蒸餾水稀釋至所需濃度。

    尼莫地平片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號:BJ24208;  SABC免疫組化染色試劑盒，博士德生物，批號:11C29C。p-actin抗體，b iow orld，批號:AP0060。 Bcl-2抗體，abeam，批號:ab182858。B ax抗體，abeam，批號:ab32503。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔工所lg（H十L），北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號:III-0011;

1.3儀器

A U M 220D電子分析天平，日本S h in ad zu公司;超低溫冰箱，美國Thermo公司;制冰機(jī)，日本Sanyo公司產(chǎn)品;高速冷凍離心機(jī)，中國中科中佳科技儀器有限公司;多功能酶標(biāo)儀，美國P erk iti E lm er公司;CM 1950冰凍切片機(jī)， A SP200S脫水機(jī)，E G 1160包埋機(jī)，RM 2135切片機(jī)，ST5020染色機(jī)，D C 300光學(xué)顯微鏡，均為德國Leica公司;小鼠條件恐懼試箱、X R -XC404條件性恐懼分析系統(tǒng)，上海欣軟科技有限公司。

1.4分組、模型制備及給藥

取雄性KM種小鼠，采用頸總動脈結(jié)扎反復(fù)缺血再灌注的方法制備經(jīng)典VD模型:小鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(10 mL}kgl)全身麻醉，分離雙側(cè)頸總動脈，用動脈夾阻斷其血流30 min，松開動脈夾恢復(fù)血流10 m in，重復(fù)3次。于第1次阻斷血流5min后，小鼠斷尾放血約0.3 m L，冷凝止血。第3次血流再灌注后30 min，觀察小鼠呼吸、心跳，待其正常后即可縫合皮膚。假手術(shù)組小鼠僅暴露雙側(cè)頸總動脈同等時(shí)間即可縫合皮膚。造模后第2天，除假手術(shù)組外，將模型小鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型組，尼莫地平對照組(30 mg/kg),  PHRE低、中、高劑量組(含生藥量5,  10,  20 g/kg }，每組12只。各組小鼠按l0mL/kg灌胃給藥，連續(xù)35 d，每天1次，假手術(shù)組及模型組灌胃等體積的蒸餾水。

1.5行為學(xué)檢測

1.5.1爬桿實(shí)驗(yàn) 第30天給藥后2h，進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn)測試。將一根長50 cm、粗1.5 cm的竹竿固定在泡沫盒上，竹竿用紗布包裹以防打滑，小鼠頭朝下放置于竹竿頂部，記錄小鼠爬完桿長全長所需時(shí)間。正式記錄評分之前，訓(xùn)練小鼠爬桿3d，每日1次，確保每只小鼠學(xué)會爬桿。根據(jù)爬桿時(shí)間進(jìn)行評分，若小鼠墜落評7分，不動評6分，40 s掉頭評5分，20 s掉頭評4分，爬完全長31一40 s者評3分，21一30 s者評2分，11一20 s者評1分，0一11 s者評0分。

1.5.2條件恐懼實(shí)驗(yàn) 

給藥34 d后進(jìn)行條件恐懼實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段，第一階段為恐懼訓(xùn)練階段，即第34天給藥2h后，將小鼠放入恐懼箱中，從20 s開始給予聲刺激(75 dB ,  2000 H )，持續(xù)10 s，從25 s開始給予光刺激，持續(xù)5s，從28 s開始足部電刺激((0.8 m A) 2 s。共進(jìn)行4個(gè)循環(huán)，間隔時(shí)間各為15 s。第二階段為測試階段，即第35天給藥2h后，將小鼠放入恐懼箱中，場景與受訓(xùn)階段場景一致，提供相同的聲、光等提示性信號，但不給予電擊，動物仍將會表現(xiàn)出恐懼反應(yīng)，通過觀察動物的僵直時(shí)間來反映動物對恐懼的記憶能力。

1.6樣本采集

恐懼實(shí)驗(yàn)結(jié)束2h后，每組隨機(jī)選取6只小鼠，腹腔注射3.5%水合氯醛（10 mL/kg}麻醉，通過心臟灌注4%多聚甲醛固定腦組織，灌注完成后，取腦組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于病理切片制作。其余小鼠斷頭處死，迅速摘取大腦，分離海馬區(qū)，用于免疫組化及W estenl Blot檢測。

1.7HE染色觀察

固定好的腦組織經(jīng)修整、脫水、包埋、切片、HE染色、封片等程序后，使用光學(xué)顯微鏡觀察小鼠海馬組織CA 1區(qū)組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.8免疫組化檢測

Bcl-2, Bax蛋白的分布及表達(dá)用T issue 0 C T-Freeze Medium包埋小鼠大腦并制作冰凍切片。嚴(yán)格按照SA B C免疫組化染色試劑盒說明依次固定、封閉、一抗孵育、二抗孵育、SA B C孵育、DAB顯色、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察，并用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)碼照相及圖片分析Bcl-2, Bax蛋白的分布及表達(dá)情況。

1.9Western Blot法檢測Bcl-2, Bax蛋白的表達(dá)

分離小鼠大腦海馬區(qū)組織，提取總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行定量。取50 ug蛋白樣本，用15%的聚丙烯酞氨凝膠進(jìn)行電泳80 V ,   20 m in，之后轉(zhuǎn)換為120V、80 min;然后采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜300 m A、1 h;TB ST洗膜10 m in ,  3次;5 %  B SA常溫封閉 4 h;4 0C孵育一抗過夜;TBST洗膜10 m in ,  3次;37 0C孵育二抗1 h;  TBST洗膜10 m in ,  3次;ECL進(jìn)行發(fā)光，用ltu age L ab 3.0軟件對W estenl B lot成像圖進(jìn)行分析，計(jì)算各組蛋白與內(nèi)參(p-actin)的相對表達(dá)值。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x士s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者使用LSD檢驗(yàn);方差不齊者使用D unnett' s檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1各組小鼠爬桿評分比較 爬桿實(shí)驗(yàn)用于評價(jià)各組間小鼠肢體協(xié)調(diào)能力的差異。評分結(jié)果顯示:假手術(shù)組、模型組及各給藥組間均無明顯差異(P > 0.05 )，表明本研究采用的VD造模方法對小鼠的運(yùn)動及平衡能力沒有造成影響，見表1 ;

2.2PHRE對小鼠條件恐懼記憶的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的僵直時(shí)間百分比顯著縮短((P<0.09，表明VD模型復(fù)制成功，小鼠的記憶能力下降。與模型組比較，尼莫地平組及PH R E中、高劑量組小鼠的僵直時(shí)間百分比明顯延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.09，表明PH R E在10-20 g/kg范圍內(nèi)對VD小鼠的記憶能力有明顯的改善作用，見圖1

2.3毛冬青提取物對VD小鼠大腦神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的影響

病理組織學(xué)檢查顯示，假手術(shù)組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)及分布未見異常。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞間質(zhì)水腫，細(xì)胞核濃染、固縮，皮層神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，且伴有大量膠質(zhì)細(xì)胞增生，多處聚集成堆，大腦海馬CA 1區(qū)的錐體細(xì)胞大量缺失、變性、壞死，齒狀回顆粒細(xì)胞變性成空泡樣。與模型組比較，PH R E低、中、高劑量組和尼莫地平組小鼠的大腦神經(jīng)元病變情況有明顯改善，體現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞增生減少，海馬CA 1區(qū)錐體細(xì)胞病變程度明顯減輕，見圖2 ;

2.4免疫組化法檢測

VD小鼠海馬CA1區(qū)凋亡蛋白Bcl-2, Bax的分布和表達(dá)結(jié)果顯示，Bcl-2, Bax呈不連續(xù)的環(huán)狀或者片狀分布，主要在胞質(zhì)表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組的Bc}2和B ax蛋白表達(dá)明顯增加。與模型組比較，尼莫地平組及PH R E中、高劑量組的Bcl-2表達(dá)增加，B ax表達(dá)減少。表明VD模型小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡，而在尼莫地平或PH R E的干預(yù)下，凋亡現(xiàn)象減少，提示毛冬青提取物可以減少VD模型小鼠的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。見圖3- 5;

2.5  Western Blot法檢測VD小鼠海馬區(qū)Bcl -2 ,Bax蛋白的表達(dá) Bcl -2水平的升高和B ax蛋白的降低表明細(xì)胞對凋亡的抵抗性增強(qiáng)，是藥物起保護(hù)作用的標(biāo)志。Bcl -2 ,Bax的比值越大，則抗凋亡能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示，與模型組比較，毛冬青提取物能提高VD小鼠海馬區(qū)Bc}2蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)降低B ax蛋白的表達(dá)，即明顯升高Bcl -2 ,Bax的比值，表明毛冬青提取物可以提高VD小鼠海馬區(qū)細(xì)胞的抗凋亡能力，從而對VD小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元起保護(hù)作用。見圖6 ;

3討論

    本研究通過血流阻斷聯(lián)合放血法復(fù)制小鼠VD模型，經(jīng)過小鼠智能測試及病理學(xué)檢查證實(shí)模型制備成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VD模型組小鼠恐懼記憶時(shí)間縮短，且腦部海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生損傷，而毛冬青提取物能夠明顯提高VD小鼠的恐懼記憶時(shí)間，降低VD小鼠神經(jīng)元細(xì)胞損傷的程度，結(jié)合其對凋亡蛋白Bcl -2 ,Bax的影響可以推斷，毛冬青通過抑制海馬CA1區(qū)的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

    大腦海馬區(qū)損傷會引起血管性癡呆，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。海馬體與大腦記憶有關(guān)，并且對腦缺血敏感Cio7。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元細(xì)胞的死亡會引起嚙齒類、靈長類動物以及人類出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。因此，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞對學(xué)習(xí)和記憶能力至關(guān)重要，然而CA1區(qū)對腦缺血尤為敏感，會引起嚴(yán)重的學(xué)習(xí)和記憶功能退化。病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VD模型組小鼠的大腦海馬CA 1區(qū)錐體細(xì)胞大量缺失、變性、壞死，并且齒狀回顆粒細(xì)胞變性成空泡樣。毛冬青提取物可阻止CA1區(qū)錐體細(xì)胞缺失，從而起到保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，改善VD小鼠學(xué)習(xí)記憶的作用。

    細(xì)胞凋亡在缺血再灌注損傷中具有重要的作用,  Bcl -2 ,Bax屬于Bcl -2家族蛋白，調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bc}2屬于抑凋亡蛋白，可以阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿。B ax屬于促凋亡蛋白，通過移位到線粒體膜上促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。Bc}2通過平衡Bcl -2 ,Bax維持線粒體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬區(qū)Bcl -2與B ax蛋白表達(dá)均有所升高，可能為小鼠大腦間斷缺血后，促凋亡蛋白B ax表達(dá)增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)由于細(xì)胞自身的保護(hù)機(jī)制，抗凋亡蛋白Bc}2表達(dá)反應(yīng)性上調(diào)，發(fā)揮抑制凋亡的作用。由于Bcl -2 ,Bax的比例決定細(xì)胞在受到凋亡信號刺激后是否發(fā)生凋亡，在VD小鼠模型中，B ax蛋白的表達(dá)占優(yōu)勢，從而導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，海馬區(qū)形態(tài)受損，記憶力出現(xiàn)障礙;與模型組比較，毛冬青提取物能夠提高Bcl -2的表達(dá)，降低B ax的表達(dá)，從而顯著提高Bc}2啟ax的比值，使海馬CA1區(qū)細(xì)胞的凋亡受到抑制。因此，毛冬青提取物可以通過調(diào)節(jié)海馬CA 1區(qū)Bcl -2 ,Bax的表達(dá)，抑制CA1區(qū)的細(xì)胞凋亡，從而改善VD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

    毛冬青已被廣泛應(yīng)用于心血管系統(tǒng)疾病的治療，療效確切。近年來，也有學(xué)者深入探討毛冬青對腦組織損傷的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛冬青提取物在高劑量時(shí)，改善VD小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的效果與尼莫地平相似，可通過抑制VD模型小鼠的腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡來提高學(xué)習(xí)記憶能力，有望發(fā)展成為一種新的治療血管性癡呆藥物。