組織谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性酶偶聯(lián)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒使用說明
組織谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性酶偶聯(lián)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑盒
產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
組織谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性酶偶聯(lián)反應(yīng)光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶的酶偶聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光譜法來測定組織裂解樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物組織裂解懸液樣品谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase；GPT；EC2.6.1.2），又稱為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase；ALT或alanine aminotransferase；ALAT），存在于各種人體組織和血液中。谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶催化丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮戊二酸（α- Ketoglutarate）的反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸和谷氨酸。檢測谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶活性，常用于評價肝功能：GPT活性異常與病毒性肝炎、充血性心衰、肝損傷、膽道疾病、傳染性單核細胞癥有關(guān)。基于底物丙氨酸（L-alanine）和α-酮戊二酸，在谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的催化作用下，轉(zhuǎn)化成丙酮酸后，通過乳酸脫氫酶系統(tǒng)，測定還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的吸光峰值變化（340nm 波長），來定量分析谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：
Alanine aminotransferase/glutamate pyruvate transaminase
α-Ketoglutarate + L-alanine → pyruvate + L-glutamate
Lactate dehydrogenase
Pyruvate + NADH → Lactate + NAD+ + H+
（高吸收峰） （低吸收峰）
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 60毫升
裂解液（Reagent B） 10毫升
緩沖液（Reagent C） 20毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 2毫升
底物液（Reagent E） 2毫升
陰性液（Reagent F） 500微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
比色皿或96孔板：用于光譜分析的容器
分光光度儀或酶標儀：用于光譜分析
實驗步驟
- 樣品準備
- 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定500毫克組織重量
- （選擇步驟）放進預(yù)冷的15毫升錐形離心管
- （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
- 移入到一個液氮凍存管
- 即刻放進液氮罐過夜
- 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
- 放進一個15毫升錐形離心管
- 加入預(yù)冷的500微升裂解液（Reagent B）
- 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
- 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/EM>）
- 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
- 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
- 測定準備
- 準備好待測樣品（例如組織裂解萃取懸液樣品等），置于冰槽里
- 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
- 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）置入冰槽里融化。緩沖液（Reagent A）在30℃溫度下均衡溫度
- 背景對照測定
- 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
- 加入100微升底物液（Reagent E）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻
- 在30℃溫度下孵育3分鐘
- 加入20微升陰性液（Reagent F）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）
- 樣品測定
- 移取750微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入100微升反應(yīng)液（Reagent D）
- 加入100微升底物液（Reagent E）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻
- 在30℃溫度下孵育3分鐘
- 加入50微升待測樣品（50微克組織裂解懸液總蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.5）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－5分鐘讀數(shù)）
五、計算樣品活性
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾NADH/分鐘
- 酶標儀測定
- 在96孔板上做好相應(yīng)標記：背景對照和樣品
- 分別移取190微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
- 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
- 分別加入25微升底物液（Reagent E）
- 輕輕搖動96孔板
- 在30℃溫度下孵育3分鐘
- 分別加入10微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（20微克組織裂解懸液總蛋白）（注意：樣品須清澈，且pH為7.5）
- 輕輕搖動96孔板
- 即刻放進酶標儀檢測，包括（0分鐘初始讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)）
- 活性計算
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.010（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾NADH/分鐘
注意事項
- 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對照
- 操作時，須戴手套
- 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
- 樣品須澄清，至關(guān)重要
- 建議使用比色皿測定
- 加樣后3秒內(nèi)光譜測定
- 測定值由高到低變化；測定可持續(xù)5分鐘
- 光譜測定后，比色皿須清洗徹底
- 背景空對照0分鐘讀數(shù)通常0.5為理想狀態(tài)
- 背景空對照的正常讀數(shù)差值（0分鐘－5分鐘）通常為0.001至0.005（正負即可）
- 樣品0分鐘讀數(shù)通常和背景空對照0分鐘讀數(shù)一致
- 樣本測定5分鐘讀數(shù)低于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
- 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/50微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
- 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
- 谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾NADH所需的酶量作為一個活性單位
- 本公司提供系列細胞酶學檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
