基因甲基化特異性PCR擴(kuò)增（MSP）試劑盒產(chǎn)品說明書(中文版)

主要用途

基因甲基化特異性PCR擴(kuò)增（MSP）試劑盒是一種旨在通過設(shè)計(jì)符合胞嘧啶轉(zhuǎn)化的特殊引物，對(duì)轉(zhuǎn)化基因組的CpG島區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，探測(cè)基因甲基化信息的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的�？梢员挥糜诟改赣∮�、X染色體研究、腫瘤抑制基因等表觀遺傳學(xué)研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，擴(kuò)增效率顯著。

技術(shù)背景

在基因的啟動(dòng)子區(qū)域（promotor region）通常存在一些富含重復(fù)雙核苷酸“CG”的區(qū)域，稱為“CpG島”（CpG island）。在人類基因組內(nèi)，存在有近3萬個(gè)CpG島。這些CpG島不僅是基因的一種標(biāo)志，而且還參與基因表達(dá)的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，更是DNA甲基化的唯一位置。CpG島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達(dá)和表觀基因組學(xué)的主要課題。

產(chǎn)品內(nèi)容

擴(kuò)增液（Reagent A） 900微升

補(bǔ)充液（Reagent B）   1毫升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

轉(zhuǎn)化樣品：經(jīng)過亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的目標(biāo)DNA分子

特異引物：用于甲基化基因擴(kuò)增的引導(dǎo)DNA分子

PCR儀：用于樣品擴(kuò)增

PCR管或平板：用于PCR反應(yīng)的容器

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，從－20℃冰箱中取出試劑，放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作：

• 針對(duì)一個(gè)樣本，每次移出15微升擴(kuò)增液（Reagent A）到PCR管
• 加入1微升用戶自備的的轉(zhuǎn)化或野生型DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入1微升用戶自備的甲基化特異性的引物F和引物R（各350納克或25微摩爾）
• 再加入7微升補(bǔ)充液（Reagent B）（反應(yīng)總量為25微升）
• 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級(jí)礦物油（注意：參見注意事項(xiàng)10）
• 即刻進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)：

• 反應(yīng)完畢后，移取5微升進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳或15%聚丙烯酰胺凝膠
• 如果進(jìn)行測(cè)序鑒定，膠回收PCR產(chǎn)物（建議使用高質(zhì)純化一步法膠回收試劑盒；20051.1）
• 分別移出2微升反應(yīng)液到2個(gè)不同的新的1.5毫升離心管（每微升100納克）
• 加入1微升用戶自備的甲基化特異性的巢式引物F（每微升350納克）到其中一個(gè)1.5毫升離心管，作好標(biāo)記
• 加入1微升用戶自備的甲基化特異性的巢式引物R（每微升350納克）到另一個(gè)1.5毫升離心管，作好標(biāo)記
• 進(jìn)行后續(xù)的直接測(cè)序反應(yīng)

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為60次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 轉(zhuǎn)化后的DNA樣本須保存在－20℃冰箱里，否則容易降解；同時(shí)盡快進(jìn)行擴(kuò)增等后續(xù)操作
• 一個(gè)特定基因的甲基化檢測(cè)通常包括轉(zhuǎn)化、PCR和直接測(cè)序三步。PCR用于篩選和定位，可以發(fā)現(xiàn)0.1%甲基化；測(cè)序是精確定位，是分析金標(biāo)準(zhǔn)
• 一個(gè)特定基因的甲基化特異性PCR通常包括三組PCR：野生型（W）、轉(zhuǎn)化后甲基型（M）、轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）
• 甲基化特異性PCR的引物設(shè)計(jì)原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個(gè)CpG位點(diǎn)；CpG位點(diǎn)須在3端；PCR片段長度在80－250堿基；三組引物取自同一位點(diǎn)，通過長度變化獲得相同的Tm，并在電泳上有所區(qū)別。
• 直接測(cè)序的引物設(shè)計(jì)原則是：引物不能含有CpG位點(diǎn)；引物含有足夠多的C（不和G相連）；采用巢式引物
• 基因甲基化區(qū)域選擇原則：如果是一個(gè)首次檢測(cè)的基因，首先，選擇啟動(dòng)子部位；第二，選擇足夠多的CpG位點(diǎn)；第三、選擇200堿基以上區(qū)域，且GC超過50%
• 通過1.8%瓊脂糖凝膠或15%聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測(cè)PCR擴(kuò)增后的結(jié)果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U”Primers將產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴(kuò)增

• 組織樣品或雜合子樣品常常出現(xiàn)“U”和“M”同時(shí)呈現(xiàn)陽性；建議使用基因甲基化程度定量分析試劑盒（20024.3）予以分析
• 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 建議使用軟件測(cè)算Tm溫度；參考公式為Tm=4（G+C）+2（A+T）
• 在－20℃冰箱里儲(chǔ)存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
• 本公司提供甲基化特異性引物設(shè)計(jì)服務(wù)
• 本公司同時(shí)提供數(shù)字化表觀基因組完全分析（全部甲基化基因）技術(shù)試劑盒和外包服務(wù)（90002）
• 本公司提供系列甲基化分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化保證
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應(yīng)產(chǎn)量高