西班牙塞利維亞大學(xué)教授José A Pintor-Toro長(zhǎng)期從事生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究， 近期，其實(shí)驗(yàn)室利用Arraystar LncRNA芯片研究發(fā)現(xiàn)了在TGF-β誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）過程早期起直接調(diào)控作用的lncRNA分子—lnc-Spry1，TGF-β誘導(dǎo)直接引起lnc-Spry1下調(diào)，從而引發(fā)EMT過程影響細(xì)胞侵襲遷移。lnc-Spry1也可與U2AF65作用，影響可變剪切，從而在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后層面調(diào)控基因表達(dá)。該研究成果發(fā)表在細(xì)胞凋亡領(lǐng)域權(quán)威期刊Cell Death & Differentiation（IF: 8.218）（芯片實(shí)驗(yàn)由Arraystar提供技術(shù)服務(wù)）

 

研究背景
    上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）過程是一個(gè)基本的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變過程。期間上皮細(xì)胞失去胞間緊密連接和與基底膜的附著極性，轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，獲得侵襲和遷移活性。在轉(zhuǎn)錄層面上，TGF-β可以直接激活EMT過程，導(dǎo)致下游通路和一系列基因表達(dá)的改變。除此之外， pre-mRNA的可變剪接和lncRNA的調(diào)控作用也在轉(zhuǎn)錄后層面上增加了調(diào)控層面的復(fù)雜性。LncRNA作為重要的調(diào)控型RNA分子，可以在多個(gè)層面影響EMT過程。目前已有的文章只研究了TGF-β信號(hào)下游和影響細(xì)胞穩(wěn)定性的lncRNA，本文章的研究目的在于找到EMT早期起直接調(diào)控作用的lncRNA分子。

 

研究思路
    為了探究EMT過程中直接影響早期調(diào)控的lncRNA分子，本次研究應(yīng)用美國(guó)Arraystar mouse LncRNA芯片篩選TGF-β誘導(dǎo)NMuMG細(xì)胞系2h后差異表達(dá)的lncRNA和mRNA。其中435個(gè)lncRNA和1090個(gè)mRNA發(fā)生了顯著差異變化。之后選擇了表達(dá)下調(diào)的Spry1臨近lncRNA—lnc-Spry1進(jìn)行研究，qPCR驗(yàn)證表達(dá)趨勢(shì)與芯片相符。
    對(duì)該lncRNA進(jìn)行功能研究發(fā)現(xiàn)，該分子在TGF-β誘導(dǎo)后15min就開始下調(diào)，說明是一個(gè)早期的調(diào)控分子，敲除Smad4后lnc-Spry1發(fā)生顯著變化，因此該lncRNA分子是TGF-β-Smad依賴通路的靶標(biāo)基因。將該分子進(jìn)行shRNA敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞特征marker vimentin和Snail1升高，上皮細(xì)胞特征marker E-cadherin降低，產(chǎn)生遷移和侵襲表型變化，說明lnc-Spry1可以重塑細(xì)胞骨架，影響細(xì)胞遷移和侵襲。
    通過研究lnc-Spry1和臨近基因Spry1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者具有表達(dá)相關(guān)性，敲除lnc-Spry1后進(jìn)行高通量檢測(cè)和GO分析，發(fā)現(xiàn)趨化因子和細(xì)胞因子相關(guān)基因發(fā)生顯著變化。進(jìn)一步進(jìn)行l(wèi)nc-Spry1的機(jī)制研究，通過RIP和RNA pull down技術(shù)，發(fā)現(xiàn)lnc-Spry1可以結(jié)合可變剪切相關(guān)蛋白U2AF65，從而影響EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)基因FGFR pre-mRNA的可變剪切過程。

 

圖一、A：TGF-β處理后芯片檢測(cè)中顯著變化的EMT相關(guān)基因；B：TGF-β處理后芯片檢測(cè)差異變化顯著的lncRNA分布散點(diǎn)圖；C：TGF-β處理后芯片檢測(cè)FC>2，P<0.05的lncRNA分布火山圖；

 

圖二、g. Lnc-spry1敲除后影響基因表達(dá)的聚類圖；h. Lnc-spry1敲除后進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)富集的GO條目與趨化因子、細(xì)胞因子相關(guān)。

 

圖三、a. RNA pull down聯(lián)合質(zhì)譜實(shí)驗(yàn) Lnc-spry1可結(jié)合U2AF65；b. RIP實(shí)驗(yàn) U2AF65可以結(jié)合Lnc-spry1。

 

研究意義
    該研究揭示了lnc-Spry1和TGF-β誘導(dǎo)的EMT早期調(diào)控之間的關(guān)系。TGF-β誘導(dǎo)NMuMG細(xì)胞直接引起lnc-Spry1下調(diào)，通過TGFβ-Smad通路重塑細(xì)胞骨架，影響細(xì)胞遷移侵襲。lnc-Spry1可與U2AF65結(jié)合，影響EMT轉(zhuǎn)化相關(guān)基因FGFR pre-mRNA的可變剪切。從而在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后層面調(diào)控基因表達(dá)。

 

作者介紹
    José A Pintor-Toro，博士。西班牙塞利維亞大學(xué)生物分子與再生醫(yī)學(xué)中心信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分部教授。長(zhǎng)期從事植物、生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究，科研成果先后在Nature Genetics，PNAS，Nucleic Acids Research, Cell Death & Differentiation 等國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表。

 

原文出處
Downregulation of Lnc-Spry1 mediates TGF-β-induced epithelial–mesenchymal transition by transcriptional and posttranscriptional regulatory mechanisms. Cell Death and Differentiation. 2017.