研究背景       長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）普遍被認(rèn)為是一類不能編碼蛋白的長鏈RNA。由于其序列較長，所以可以有較大的潛力形成多種復(fù)雜構(gòu)象，從而通過不同生物學(xué)途徑發(fā)揮其作用。此外，由于其不具備蛋白編碼能力，因此此類RNA也主要由其堿基序列形成的高級結(jié)構(gòu)來執(zhí)行生物學(xué)功能。著名的lncRNA包括CRISPR基因編輯系統(tǒng)中的guide RNA（腳手架功能，scafford）、神經(jīng)細(xì)胞中特異表達(dá)的pnky（蛋白互作）以及X染色體沉默相關(guān)的Xist（蛋白互作）等。這些lncRNA通過其各自的形態(tài)結(jié)構(gòu)廣泛參與了各種生理生化過程。

       然而，正是由于lncRNA復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白的爭論，這使得研究人員對lncRNA的探索困難重重。但是，這也并不是說對lncRNA的研究沒有任何思路和軌跡可循�？茖W(xué)研究雖然沒有捷徑，但是找對方向，少走彎路遠(yuǎn)比無頭蒼蠅到處飛要高效的多。lncRNA研究雖然在當(dāng)下頗有難度，但是只要遵循最基本的生命科學(xué)研究的遺傳學(xué)思維，也可以大大降低lncRNA的研究難度。那么，今天大家就隨小編一同來看一篇2017年6月剛發(fā)表在Nature Cell Biology雜志上的lncRNA反向遺傳學(xué)案例。在了解lncRNA在肝癌發(fā)生中的生物學(xué)作用的同時(shí)，也來學(xué)習(xí)一下lncRNA的反向遺傳學(xué)研究套路。
 

主要研究結(jié)論

1. MBNL3癌胚的剪切因子，促進(jìn)腫瘤發(fā)生導(dǎo)致肝癌預(yù)后較差
2. MBNL3敲降可以逆轉(zhuǎn)肝癌發(fā)生
3. MBNL3誘導(dǎo)lncRNA-PXN-AS1第四個(gè)外顯子富集
4. PXN-AS1-L促進(jìn)PXN基因表達(dá)，PXN-AS1-S影響PXN基因穩(wěn)定性
5. MBNL3、PXN與PXN-AS1-L/PXN-AS1-S一同調(diào)控肝癌發(fā)生

研究思路
研究結(jié)果
 

1. MNBL3表達(dá)量與肝癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)分析

       由于在之前的工作中，研究人員已經(jīng)通過表達(dá)譜芯片的方法鑒定到了一個(gè)在小鼠和人類肝癌組織中高表達(dá)的基因mnbl3，因此本工作希望能夠?qū)Ω伟┌l(fā)生的表型從mnbl3的角度進(jìn)行分子機(jī)制的研究。

       通常而言，反向遺傳學(xué)研究在通過某一個(gè)性狀確定待研究對象（mRNA、lncRNA、circRNA等）之后，便需要對其進(jìn)行表型觀察。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，表型觀察可以包括對特定細(xì)胞系的基因編輯和過表達(dá)等以及對臨床樣本進(jìn)行體內(nèi)的表型研究等。在此，研究人員采取了傳統(tǒng)的反向遺傳學(xué)研究思路，首先對臨床病人的生存率和mbnl3表達(dá)量進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mbnl3的高表達(dá)往往伴隨了肝癌病人的高死亡率(圖1a-h）。并且該結(jié)果在對人類永生未轉(zhuǎn)化的肝臟細(xì)胞系（QSG-7701），肝癌細(xì)胞系（SMMC-7721，HCCLM3，MHCC97H，Huh7和Hep3B）以及肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（HepG2）的研究中均得以確認(rèn)。 2. 轉(zhuǎn)錄因子OCT4，SOX2以及NANOG可以增加MBNL3的表達(dá)

       為了詳細(xì)闡明MBNL3在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)機(jī)制，研究人員聚焦在了3個(gè)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OCT4，SOX2以及NANOG上。OCT4，SOX2以及NANOG異常表達(dá)可以增加MBNL3的表達(dá)量。與MBNL3一致，OCT4，SOX2以及NANOG在肝癌細(xì)胞系以及臨床樣本中同樣高表達(dá)。生信分析以及ChIP實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合在MBNL3的啟動子上(圖1k，i）。這些結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞系以及臨床樣本中MBNL3的高表達(dá)是由OCT4，SOX2以及NANOG這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。

3. MBNL3在肝癌細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化肝臟細(xì)胞中的致癌性

       為了研究MBNL3在肝癌形成中的作用，研究人員對SMMC-7721和QSG-7701進(jìn)行了MBNL3的穩(wěn)定過表達(dá)（圖2）。通過TUNEL等實(shí)驗(yàn)的確認(rèn)，研究人員認(rèn)為MBNL3可以驅(qū)動肝癌的發(fā)生。該結(jié)果在臨床病人樣本中同樣獲得了證實(shí)（圖2）。 4. MBNL3對肝癌的發(fā)生必不可少

       為了對MBNL3的表型進(jìn)行詳細(xì)研究，研究人員不僅對MBNL3進(jìn)行了過表達(dá)，還同樣對其在細(xì)胞系中進(jìn)行了敲降實(shí)驗(yàn)，以此來確認(rèn)MBNL3在肝癌發(fā)生中的重要地位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，MBNL3敲降的肝癌細(xì)胞系癌細(xì)胞的生長顯著受到抑制（圖3）。該結(jié)果連同MBNL3過表達(dá)的表型數(shù)據(jù)不僅確立了MBNL3在肝癌發(fā)生中的主導(dǎo)地位，同時(shí)還為肝癌診斷與治療的臨床應(yīng)用提供了潛在的治療靶標(biāo)。

5. MBNL3誘導(dǎo)lncRNA-PXN-AS1第四個(gè)外顯子積累

       在之前對MBNL3的反向遺傳學(xué)研究中，研究人員已經(jīng)成功的對MBNL3的表型進(jìn)行了深入研究，獲得了強(qiáng)有力的證據(jù)證實(shí)了MBNL3在肝癌發(fā)生中的核心地位。然而一個(gè)完整的反向遺傳學(xué)研究光有表型數(shù)據(jù)還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，在此研究人員還對MBNL3調(diào)控肝癌發(fā)生的具體分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究。為達(dá)此目的，研究人員首先使用了伯豪生物的全轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)對穩(wěn)定敲除MBNL3的SMMC-7721細(xì)胞系以及對照進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄層面的觀察。對RNA-Seq數(shù)據(jù)結(jié)果除了GO和GSEA富集分析外，研究人員還對找到了527個(gè)存在顯著差異的基因可變剪切。在最顯著的可變剪切基因中，研究人員關(guān)注到了一個(gè)名為lncRNA-PXN-AS1的基因。該基因有5個(gè)外顯子，其反義鏈編碼PXN基因。對lncRNA-PXN-AS1基因研究發(fā)現(xiàn)，其含有2個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄本分別為PXN-AS1-L（包含第四個(gè)外顯子）以及PXN-AS1-S（不包含第四個(gè)外顯子）（圖4）。MBNL3的過表達(dá)會導(dǎo)致第四個(gè)外顯子顯著富集（這暗示了MBNL3可以上調(diào)PXN-AS1-L的表達(dá)）。紫外交聯(lián)的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了MBNL3可以識別4號外顯子下游內(nèi)含子的堿基。 6. PXN-AS1-L以及PXN-AS1-S對PXN具有相反的調(diào)控作用

       由于PXN-AS1-L和PXN-AS1-S的反義鏈可以轉(zhuǎn)錄出和腫瘤相關(guān)的PXN基因。因此，研究人員懷疑PXN-AS1-L和PXN-AS1-S可能參與了對PXN的調(diào)控。研究人員首先通過實(shí)驗(yàn)與生信分析確認(rèn)了PXN-AS1-L和PXN-AS1-S都是不具備編碼蛋白能力的lncRNA。其次，對PXN-AS1-L和PXN-AS1-S在SMMC-7721細(xì)胞系中的過表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PXN-AS1-L過表達(dá)可以導(dǎo)致PXN表達(dá)量上升。然而，令人意想不到的是，PXN-AS1-S過表達(dá)卻導(dǎo)致了PXN表達(dá)量下降。通過對這兩個(gè)lncRNA的深入分析，研究人員發(fā)現(xiàn)PXN-AS1-L是通過結(jié)合PXN mRNA的3‘ UTR，保護(hù)了PXN mRNA不受miR-24-AGO2復(fù)合物降解，從而提高了PXN的表達(dá)豐度。與PXN-AS1-L完全不一樣的是，PXN-AS1-S則通過結(jié)合PXN mRNA的CDS區(qū)域，抑制了PXN mRNA的翻譯延升，從而抑制PXN蛋白在體內(nèi)的含量（圖5）。MBNL3則是通過誘導(dǎo)lncRNA-PXN-AS1的4號外顯子表達(dá)，間接的增加PXN的表達(dá)豐度(圖6）。
6. lncRNA-PXN-AS1的4號外顯子的生物學(xué)功能

       為了對lncRNA-PXN-AS1的4號外顯子在肝癌發(fā)生過程中的生物學(xué)作用有進(jìn)一步的了解，研究人員通過對PXN-AS1-L和PXN-AS1-S分別與肝癌發(fā)生進(jìn)行了表型關(guān)聯(lián)。結(jié)果證明，PXN-AS1-L和PXN-AS1-S在肝癌發(fā)生過程中具有相反的生物學(xué)功能(圖7）。

7. MBNL3，lncRNA-PXN-AS1剪切以及PXN在臨床組織中的關(guān)聯(lián)分析

       如果把一篇完整的邏輯縝密的科研論文比做一篇小說，那么這篇小說不僅僅是內(nèi)容精彩的小說，還應(yīng)該是一篇具有完美結(jié)局而非虎頭蛇尾的小說。用初中作文的寫作技巧來描述的話，就叫做前后呼應(yīng)。本研究工作，起始于對MBNL3的功能研究，牽扯到了lncRNA-PXN-AS1以及PXN等，而最終也必將以MBNL3來終結(jié)。因此，在本工作最后，研究人員還從整個(gè)信號通路的層面闡述了MBNL3和其互作大分子在肝癌發(fā)生中的作用，大大增加了人們對肝癌發(fā)生的認(rèn)識(圖8）。

討論

       從肝癌研究人員的角度來看，本工作確實(shí)是一篇少有的好文章。其意義在于尋找到了一個(gè)在肝癌發(fā)生過程中起到主效調(diào)控作用的信號通路。為將來肝癌的臨床診斷與治療提供了極大的幫助。從旁觀者的角度來看，本工作又確實(shí)是一篇及其典型的lncRNA反向遺傳學(xué)研究案例。從性狀到基因定位，再到表型觀察繼而分子機(jī)制研究，完美地詮釋了反向遺傳學(xué)研究的精髓。為我們對lncRNA研究同仁們提供了絕佳的研究思路。綜合以上兩點(diǎn)，本工作發(fā)表在Nature Cell Biology上是實(shí)至名歸的。

原文出處：
Yuan JH, Liu XN, Wang TT, Pan W, Tao QF, Zhou WP, Wang F, Sun SH. The MBNL3 splicing factor promotes hepatocellular carcinoma by increasing PXN expression through the alternative splicing of lncRNA-PXN-AS1. Nat Cell Biol.2017.