WB檢測中二抗的選擇方法
二抗選擇
二抗是用一抗免疫動物制備的抗一抗的抗體，選擇范圍較窄，基本是商品化的，在不考慮二抗修飾類型的前提下，二抗的選擇需要遵循以下原則：二抗來源種屬、一抗來源種屬和抗原來源種屬互不相同。例如如果研究對象是人的蛋白X，選擇了鼠抗X一抗，則可選擇兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗選擇要考慮的問題有：
①對單抗類一抗，二抗需與一抗的類別或亞類相匹配（多抗類一抗主要是IgG類免疫球蛋白故相應二抗就是抗IgG抗體，不作考慮）。
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一抗類別或亞類 |
二抗 |
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IgM |
抗IgM |
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IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 |
抗IgG、抗IgG1、抗IgG2a、抗IgG2b、抗IgG3 |
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未知 |
抗IgG |
②某些組織或細胞含有較多的Fc受體，如脾臟、淋巴細胞等，此時二抗需要選擇抗IgG F(ab’)2二抗，避免各種Ig保守結(jié)構(gòu)域?qū)е碌慕徊娣磻Ｈ欢鞣NIg仍具有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此還是有一定程度的交叉反應。
WB檢測之內(nèi)參抗體
Western Blot檢測方法不僅能檢測靶蛋白存在與否，還能比較不同條件下或者不同組織中靶蛋白的相對表達量，可作為蛋白表達水平最直接的證據(jù)。在WB實驗中有眾多不確定因素影響靶蛋白表達水平的測定，如方法學本身性質(zhì)、操作誤差等。為準確衡量靶蛋白表達水平，需要精確一致的上樣量，使用內(nèi)參的意義即是保證上樣量的一致。內(nèi)參即內(nèi)部參照（Internal Control），對哺乳動物細胞一般指管家基因的表達蛋白(Housekeeping Proteins)。此類蛋白在各組織和細胞中的表達相對恒定，可作為檢測蛋白表達水平變化的參照物。當內(nèi)參條帶亮度基本一致時，基本可以確定上樣量是一致的，通常采用比較靶蛋白和內(nèi)參蛋白條帶亮度比值來進行相對定量。
WB實驗中涉及到的蛋白-抗體結(jié)合是一個復雜的活性生物大分子間的相互作用，眾多因素都會影響實驗的結(jié)果。例如時間、溫度、濃度、離子強度等，在實驗設計時就需要有嚴謹?shù)膶φ辗桨�，通過對照就容易判斷問題所在，嚴謹?shù)腤B實驗中需要設立蛋白分子量標準、空白載體對照、未誘導對照、已知量標準物正對照和內(nèi)參。
內(nèi)參使用方法
1.標記內(nèi)參：酶標的內(nèi)參抗體可避免二抗結(jié)合總蛋白中某些免疫球蛋白產(chǎn)生的雜帶，使用時只需在二抗孵育時加入酶標內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。
2.普通內(nèi)參：當靶蛋白分子量與所選內(nèi)參分子量相差不大時，可先對靶蛋白進行顯色檢測，然后用Strip緩沖液洗掉膜上抗體，重新對內(nèi)參蛋白進行顯色檢測。當靶蛋白分子量與所選內(nèi)參分子量相差較明顯時，可對轉(zhuǎn)膜預染，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量將膜剪為兩部分并分開進行靶蛋白和內(nèi)參蛋白的顯色檢測。
內(nèi)參抗體選擇
常用的蛋白內(nèi)參有GAPDH和β-actin或β-tubulin，內(nèi)參的選擇原則是選擇與靶蛋白分子量相差5KD以上的內(nèi)參，對不同的樣本則需要根據(jù)實際情況進行選擇。
1.根據(jù)物種選擇
哺乳動物來源的組織或細胞樣本通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na+/K+-ATPase等。植物來源的樣本常選擇plant actin、Rubisco等。對于其他研究稀少的物種可參考報導的文獻進行選擇。以GAPDH為例，抗GAPDH單抗（ABGENT，clone 6C5）能夠與非洲蟾蜍、猴、豬、羊、狗、貓、魚、蛙、雞、兔、小鼠、大鼠及人組織來源的GAPDH反應，但不能與酵母GAPDH反應。
2.根據(jù)組織類型選擇
以肌動蛋白actin為例，肌動蛋白actin在不同物種之間高度保守，且同一物種不同類型actin的序列相似性大于90%，使其很難獲得特異性較好的抗actin抗血清。但同一物種不同類型actin的N段序列相似性僅50~60%，故N端序列常被用來制備抗actin的抗體。脊椎動物肌動蛋白分為α、β和γ三種類型，α型分布于心肌、橫紋肌細胞和平滑肌細胞中，γ型分布于平滑肌細胞和非肌細胞中，β型分布于非肌細胞中，共六種actin蛋白。不同廠商生產(chǎn)抗β-actin抗體過程中選擇的免疫區(qū)段在不同型actin之間的保守與否影響到抗體的組織特異性。選用β-actin N端的16個氨基酸序列制備的單多抗占大多數(shù)，這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用β-actin C端16個氨基酸序列制備的抗體則可以在肌肉細胞中檢測到actin的信號。
3.根據(jù)蛋白組分選擇
提取細胞蛋白組分過程中，胞漿蛋白通常是最先提取出來的。離心全細胞裂解液所得的上清含胞漿蛋白，而沉淀含胞核蛋白和胞膜蛋白，繼續(xù)加大裂解程度即可提取到胞核蛋白，最后才能提取到胞膜蛋白。通過特殊的方法還可以從胞漿蛋白中提取到線粒體蛋白、葉綠體蛋白等。針對不同的細胞組分需要選擇不同的內(nèi)參抗體。
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類目 |
內(nèi)參 |
觀測分子量 |
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細胞總蛋白 |
GAPDH |
36 kDa |
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β-actin |
42kDa |
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β-tubulin |
55kDa |
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胞膜蛋白 |
Na+/K+-ATPase |
100kDa |
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Integrin |
90-160kDa |
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胞漿蛋白 |
caveolin-1 |
20-24kDa |
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Actin |
42kDa |
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Tubulin |
50kDa |
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線粒體蛋白 |
VDAC1 |
35-37kDa |
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COX IV |
17kDa |
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胞核蛋白 |
Lamin A |
65 kDa,70kDa |
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Lamin B |
66-70kDa |
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Histone H3 |
18kDa |
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PCNA |
36kDa |
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laminA/C |
74kDa |
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Caveolin |
20-24kDa |
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TATA binding protein |
鼠源：33-36kDa 人源：37-43kDa |
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Pax-5 |
45kDa |
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Rb |
110kDa |
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c-Jun |
43 kDa,48kDa |
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c-Fos |
62kDa |
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nucleoporin p62 |
61kDa |
在選擇細胞總蛋白內(nèi)參時，GAPDH、β-actin、tubulin三種內(nèi)參同時發(fā)生變化的情況很少。如出現(xiàn)這種情況，可用胞核內(nèi)參甚至線粒體內(nèi)參代替。另外，不同的實驗目的應選擇不同的內(nèi)參，例如檢驗質(zhì)核分離效果應選擇胞漿蛋白內(nèi)參actin，抽提的核組分中檢測不到actin則表示質(zhì)核分離效果較好。
總之，內(nèi)參的選擇要根據(jù)實際情況而定，不僅要考慮到物種、組織、組分等因素，還需要考慮到實際的實驗設計。如實驗設計中包括組織缺氧、糖尿病等因素變量，則不適宜選擇GAPDH作內(nèi)參，研究細胞增殖的相關實驗中則不適宜選擇c-Jun作內(nèi)參，在凋亡實驗中則要避免使用TBP、Lamin等。
