摘要

近期，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被廣泛地應用于突變體小鼠的構建，但是借助于微注射方法很大程度上限制了基因編輯于高通量上的應用。這篇文章中，我們闡述了一個簡單，高效，大規(guī)模的基因編輯方法：即借助于電轉染將RNAs轉入卵，而不是通過顯微注射。我們用這種方法將單鏈寡脫氧核苷酸（ssODN）轉入小鼠卵，構建敲除突變體。研究結果證明此方法使得大規(guī)�；�因分析成為現(xiàn)實。

材料和方法

小鼠、卵和胚胎

使用ICR和B6D2F1(C57BL/6XDBA2F1)孕鼠。ICR主要用于電轉條件摸索，而B6D2F1用于基因編輯。

從E0.5的輸精管中收集受精卵。ICR和B6D2F1和同種雄鼠自然雜交�；�因編輯試驗中，從B6D2F 1和R26-H2b-mCherry雄性雜交得到的卵，培養(yǎng)在mWM培養(yǎng)基中等待電轉染。

電轉染

應用BEX定制電極（長：10mm，寬：3mm，高：0.5mm，間距：1mm）圖1.

電極連接在CUY21EDIT II主機上面（BEX，Tokyo，Japan），并將電極置于體視顯微鏡下。培養(yǎng)在mWM中的卵用Opti-MEM I 清洗三次。加入5ul的RNA進行混合，放置于電極狹縫中�？梢噪娹D40-50個胚胎。電轉條件設定為30V，7times。電轉之后，立即將卵轉出在mWM培養(yǎng)基中，37℃,5%CO2培養(yǎng)。轉染后15h觀察mCherry熒光。

結果與分析

分別借助mCherry mRNA和無肢基因Fgf10進行轉染，得到電轉受精卵存活并發(fā)育成兩細胞階段的比率是94-95%，比微注射方法（34-35%）要高很多。

當我們使用400ng/ul的Cas9 mRNA和200ng/ul gRNA進行轉染，87%的胚胎表現(xiàn)出缺失前、后腿，圖2c（type I）所示；對I型突變體進行測序，發(fā)現(xiàn)Fgf10基因等位基因全部被打斷。

隨后，我們檢測了不同濃度的Cas9 mRNA和gRNA對于基因編輯的效率。200ng/ul Cas9 mRNA和50ng/u的gRNA，73%的胚胎無肢；100ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，32%展示肢體殘缺（圖2bc)；50ng/ul Cas9 mRNA 和25ng/ul的gRNA，胚胎大多正常。

為了進一步確定基因組編輯的效率，將mCherry mRNA轉入11只小鼠中，發(fā)現(xiàn)所有11個小鼠都沒有紅色熒光（圖3b）。這一結果說明電轉染的方法還可以用于高效產生HDR介導的基因敲除小鼠。

接下來，我們探討了這種突變是否會在下一代中遺傳下來。電轉200ng/ul Cas9 mRNA和100ng/ul的gRNA入卵細胞，靶向mCherry基因。 觀察25只F0代小鼠，均無紅色熒光表達。而且所有的F1代小鼠同樣沒有紅色熒光，說明mCherry基因被打斷。以上揭示了應用該電轉染方法得到的基因編輯突變體是可以穩(wěn)定遺傳。

圖2借助電轉染方法實現(xiàn)的CRISPR/Cas9基因編輯         圖3電轉染mCherry RNA形成的缺失突變體

討論

綜上所述，借助電轉染方法我們確立了一種高效高存活率的CRISPR/Cas9基因編輯方法。 因為電轉染的方法不需要微注射技術就可以同時處理40-50個胚胎，使得構建小鼠突變體更簡單快速。便于大規(guī)模的快速分析F0表型等研究。