上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院房靜遠教授主要從事消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的分子機制、早期診斷和分子治療等相關研究。近期，該課題組應用美國Arraystar公司的lncRNA芯片分析了胃癌組織的lncRNAs表達情況，篩選到可預測胃癌發(fā)生的分子標志物GClnc1，并且闡明了GClnc1在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中是如何發(fā)揮調控作用的。該研究成果于2016年發(fā)表在國際著名學術期刊Cancer Discovery(影響因子19.783)上。（芯片實驗由康成生物提供技術服務）

研究背景

胃癌（GC）是一種常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在癌癥患者中位列第四。由于早期缺乏特異性癥狀，大多數(shù)患者被診斷時已經(jīng)處于胃癌晚期。晚期胃癌患者的預后較差，并最終死于術后的癌癥復發(fā)和轉移。近幾年，科學家一直致力于尋找用于檢測早期胃癌或者可以反映個體患癌風險較高的生物標志物，但是收效甚微。非編碼RNAs是一類長度在200nt以上的長鏈非編碼RNA，研究表明lncRNA的異常表達和癌癥的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系，比如HOTAIR、MALAT1和H19等在癌癥的發(fā)生中都扮演著重要的角色。前期已有文獻報道lcnRNA在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但是其具體的作用機制還需要進一步的探究。

本文的研究目的就是借助lncRNA芯片來篩選可以用于檢測胃癌的生物標志物，并通過大量的功能實驗來驗證異常表達的lncRNA是如何調控胃癌相關的信號通路。

研究思路

作者首先檢測了10個胃癌病人的胃癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA的表達情況（Arraystar human lncRNA v2.0），借助比較嚴格的篩選條件（原始信號值>1500, Foldchange>2以及P-value<0.01）找到了8個在胃癌組織中表達顯著增加的候選lncRNAs。接著擴大樣本進行RT-PCR驗證，從而鎖定了其中的4個lncRNAs進行后續(xù)的研究。

接下來，作者對這4個lncRNAs做了臨床分析（KM和ROC曲線），發(fā)現(xiàn)只有l(wèi)ncRNA BC041951的異常表達和胃癌是顯著相關，并且BC041951的表達量從正常胃組織到胃癌的四個階段是逐漸增加。因此，推測lncRNA BC041951可以作為預測胃癌發(fā)生的生物標志物，并進行后續(xù)的功能和機制研究，同時將lncRNA BC041951命名為GClnc1。

為了進一步探究GClnc1和胃癌的關系，作者做了一系列的生物信息學分析以及功能性實驗。作者先將GClnc1敲除，然后借助RNA-seq來篩選GClnc1可能調控的基因。通過RNA-seq找到異常表達的基因后進行基因集富集分析（GSEA），發(fā)現(xiàn)GClnc1調控的基因中大部分都是癌相關基因，比如c-MYC和CDK1等。同時，功能性實驗也證明GClnc1可以促進癌細胞的增殖和入侵，最后促進胃癌的發(fā)生。

lncRNAs可以通過和轉錄因子或者其他細胞因子結合來發(fā)揮功能。為了探究GClnc1具體的作用機制，作者利用RNA pull down實驗和質譜來尋找GClnc1可能結合的蛋白。通過質譜實驗，作者鑒定了近200個蛋白，同時選取了其中的10個和轉錄調控相關的蛋白進行WB驗證。結果發(fā)現(xiàn)，只有蛋白WDR5和KAT2A可以和GClnc1特異性結合，其中WDR5是H3K4甲基轉移酶，而KAT2A是H3K9乙酰轉移酶。接下來，作者利用siRNA和RIP實驗進一步證明了GClnc1可以特異性和蛋白WDR5以及KAT2A結合形成復合物。

為了驗證GClnc1是否可以調控蛋白WDR5和KAT2A在全基因組的結合位點，作者借助ChIP-seq和RNA-seq實驗做了進一步的驗證（GClnc1 shRNA VS control shRNA）。結果表明，GClnc1敲低后會導致蛋白WDR5和KAT2A在全基因組上的結合能力下降，進而使得相應基因的表達水平也會受到抑制。因此，作者推測GClnc1做為WDR5和KAT2A形成復合物的支架來調控兩個蛋白對于組蛋白的修飾能力，進一步調控基因的表達和生物學功能。

根據(jù)ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶SOD2是WDR5和KAT2A復合物的一個靶基因，并且根據(jù)CNC分析發(fā)現(xiàn)SOD2和GClnc1之間也具有高度相關性（正相關）。作者分析了GClnc1和SOD2在基因組上的位置關系，發(fā)現(xiàn)GClnc1的部分序列和SOD2的3’端的最后一個外顯子重疊，并且經(jīng)過生信分析發(fā)現(xiàn)兩者之間不存在共同的miRNA結合位點。作者接著做了一系列的功能實驗（GOF/LOF）來驗證GClnc1以及SOD2的生物學功能，發(fā)現(xiàn)GClnc1確實可以通過調控SOD2來促進胃癌的發(fā)生和發(fā)展。作者接下來的目的就是研究GClnc1是如何調控SOD2來發(fā)揮生物學功能的。

作者推測H3K4me和H3K9A可能調控基因SOD2的轉錄。RT-PCR和Westernblot實驗也表明敲低WDR5或KAT2A可以減弱由GClnc1誘導的SOD2表達水平的上調。這就表明WDR5、KAT2A和GClnc1可能共同調控SOD2的表達（通過調控SOD2啟動子組蛋白修飾）。接下來作者就對此進行了驗證，ChIP實驗表明WDR5和KAT2A可以直接結合在SOD2的啟動子區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)敲低WDR5、KAT2A或GClnc1都會顯著降低另外一種蛋白在SOD2上的結合能力，說明GClnc1在調控WDR5/KAT2A和SOD2啟動子區(qū)域的結合過程中扮演著重要角色。作者進一步證明在SOD2啟動子區(qū)域存在H3K4me3和H3K9Ac，并且改變GClnc1的表達水平，H3K4me3和H3K9Ac的豐度也會發(fā)生變化。ChIRP分析顯示GClnc1直接結合在SOD2的啟動子區(qū)域。

上述研究表明GClnc1可以做為一個支架把組蛋白修飾酶WDR5和KAT2A招募至SOD2的啟動子處，從而激活該基因的轉錄，進而促進胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

技術路線

結果展示

圖1. RT-PCR驗證及臨床分析

圖2. 受GClnc1調控的基因做GSEA分析

圖3. RNA pull down-MS分析和Westblot驗證
 

圖4. CNC分析及驗證

研究意義

本研究借助美國Arraystar公司的human lncRNA array在胃癌中篩選到大量異常表達的lncRNA，臨床分析發(fā)現(xiàn)lncRNA GClnc1可以做為預測胃癌發(fā)生的生物標志物。接著，作者還做了大量的生信分析和功能實驗來探究GClnc1是如何促進胃癌發(fā)生和發(fā)展的。總之，GClnc1可以做為治療胃癌的一個潛在靶點；并且本研究的芯片數(shù)據(jù)對胃癌的診斷和治療，以及探究非編碼RNA的分子機制奠定了基礎。


原文出處
A novel lncRNA GClnc1 promotes gastric carcinogenesis and may act as a modular scaffold of WDR5 and KAT2A complexes to specify the histone modification pattern. Cancer Discovery. 2016.