抗郁丸對(duì)CUMS抑郁癥大鼠行為學(xué)及機(jī)理的影響

摘要：目的 研究抗郁丸對(duì)慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）抑郁癥大鼠行為學(xué)及血清中甲狀腺激素、細(xì)胞因子的影響，探討抗郁丸治療抑郁癥的作用機(jī)理。

方法 采用慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)方法構(gòu)建CUMS大鼠模型。60只雄性大鼠隨機(jī)分為正常組（10只）和模型組（50只），模型組造模3周后，隨機(jī)分為模型對(duì)照組、丙咪嗪組及抗郁丸低、中、高劑量組，每組10只，記錄大鼠體重及糖水消耗量變化，并進(jìn)行開場(chǎng)行為檢測(cè)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)及懸尾實(shí)驗(yàn)。給藥8周后處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，測(cè)定大鼠血清中甲狀腺激素及細(xì)胞因子含量。

結(jié)果 模型對(duì)照組大鼠體重增長(zhǎng)減慢，糖水消耗量減少，行為運(yùn)動(dòng)得分降低，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間及懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0．05），血清中四碘甲狀腺激素氨酸（T4）、促甲狀腺激素（TSH）含量降低（P＜0．05），白介素1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子（TNF－α）及IL－6含量升高（P＜0．05），與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。抗郁丸及丙咪嗪可加快模型大鼠的體重增長(zhǎng)，增加糖水消耗量，增加行為學(xué)得分，縮短強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間及懸尾不動(dòng)時(shí)間（P＜0．05），并提高血清中T4及TSH含量（P＜0．05），不同程度降低IL－1β、TNF－α及IL－6水平（P＜0．05），與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)論 抗郁丸能改善CUMS大鼠抑郁癥狀，逆轉(zhuǎn)抑郁癥大鼠血清中甲狀腺激素及細(xì)胞因子的含量，這可能是其發(fā)揮抗抑郁作用的重要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激；抑郁癥；甲狀腺激素；細(xì)胞因子

抑郁癥是一種由于身體某些器官功能紊亂或長(zhǎng)期失落心境而引起的慢性應(yīng)激病理狀態(tài)，其發(fā)病率高、發(fā)病年齡廣泛，嚴(yán)重威脅人們的健康和生命，導(dǎo)致沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。資料顯示，全球抑郁癥發(fā)病率為4．2％，中國(guó)高達(dá)6．9％，并且以11．3％的增長(zhǎng)率逐年增加。據(jù)預(yù)測(cè)到2020年抑郁癥將上升為全球第二大疾病負(fù)擔(dān)。因此，對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制及治療的探討成為世界關(guān)注的重點(diǎn)。目前臨床常用藥物包括三環(huán)類、四環(huán)類、神經(jīng)遞質(zhì)類抑制劑、單胺氧化酶抑制劑等，但由于副作用大、療效不理想、依從性差制約了臨床應(yīng)用。而抑郁癥是一種典型的生物、心理、社會(huì)等多因素作用導(dǎo)致的疾病，可引起人體多系統(tǒng)的病理反應(yīng)，因此多層次、多靶點(diǎn)的中醫(yī)治療具有一定的潛力和優(yōu)勢(shì)。根據(jù)傳統(tǒng)的疏肝解郁名方，我們開發(fā)出的抗郁丸以抗抑郁為主，兼有健脾理氣、養(yǎng)血柔肝、清熱除煩、養(yǎng)心安神之功效，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激（chronicunpredictablemildstress，CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)方式構(gòu)建大鼠抑郁癥模型，研究抗郁丸對(duì)抑郁癥的功效，并以三碘甲狀腺氨酸（triiodothyronine，T3）、四碘甲狀腺氨酸（tetraiodothyronine，T4）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulatinghormone，TSH）以及白介素-1β（interleukin1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactorα，TNF-α）為觀測(cè)指標(biāo)，初步探討其作用機(jī)理。

1材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組

選用SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，體重（200±10）g，由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SCXK（粵）2011－0029。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)體重隨機(jī)分為正常組（n＝10）和模型組（n＝50），正常組5只／籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中不受任何刺激，模型組單籠飼養(yǎng)，采用CUMS法，每天隨機(jī)進(jìn)行一種應(yīng)激：禁食（24h）、禁水（24h）、夾尾（1min）、晝夜顛倒、潮濕墊料（墊料：水＝1∶1）、鼠籠傾斜（45°）、冰水游泳（4℃，5min）、合籠（5只／籠，24h），前后兩天刺激不能相同，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生種類，避免產(chǎn)生適應(yīng)現(xiàn)象。造模3周后，將模型組大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為模型對(duì)照組（雙蒸水5ml／kg）、丙咪嗪組（15mg／kg）、抗郁丸低劑量組（144mg／kg）、中劑量組（288mg／kg）、高劑量組（576mg／kg），每組10只，各組每日灌胃一次，從第4周開始，連續(xù)給藥8周，給藥同時(shí)繼續(xù)進(jìn)行刺激。

1．2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

抗郁丸，由無(wú)限極（中國(guó)）有限公司研發(fā)中心提供的復(fù)合藥，0．6g／片，主要成分為當(dāng)歸、川芎、陳皮、香附、白芍。低、中、高劑量組大鼠的給藥劑量分別按照相當(dāng)于成人使用量的0．5倍、1倍、2倍計(jì)算，配置成相應(yīng)濃度的混懸液（144、288、576mg／kg），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩１�咪嗪（廣州市天騏生物科技有限公司），劑量15mg／kg，蔗糖（廣州輝旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），用大鼠日常飲用水配置成1％濃度溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。T3ELISA檢測(cè)試劑盒、T4ELISA檢測(cè)試劑盒、TSHELISA檢測(cè)試劑盒、IL-1βELISA檢測(cè)試劑盒、TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒、IL-6ELISA檢測(cè)試劑盒（廣州市一科生物科技有限公司）。開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)敞箱（100cm×100cm×40cm）、強(qiáng)迫游泳玻璃缸（35cm×35cm×50cm）由上海欣軟信息科技有限公司定制；電子分析天平（MettleToledo，Swiss），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，Germany），Elx800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（ELX800Bio-TecInstruments）。

1．3 各種行為學(xué)檢測(cè)

1．3．1體重測(cè)量與糖水消耗量測(cè)量

于同等條件下每周進(jìn)行1次體重及糖水消耗量測(cè)定。適應(yīng)性飼養(yǎng)的1周對(duì)大鼠進(jìn)行1％糖水偏好訓(xùn)練，每籠并排放置2個(gè)水瓶，兩瓶均為糖水放置24h，隨后一瓶糖水，一瓶純水放置24h，再經(jīng)過(guò)24h禁食禁水后，進(jìn)行第一次糖水消耗量基線測(cè)定，造模開始后的每周在固定時(shí)間測(cè)定一次，測(cè)定時(shí)均為單籠。以1h糖水消耗量為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1．3．2開場(chǎng)行為實(shí)驗(yàn)

于造模前、造模3周后、給藥8周后用開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱進(jìn)行行為學(xué)觀察。開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱100cm×100cm×40cm，周壁為黑色，底面用白線劃分為面積相等的25個(gè)小方格。將單只大鼠置于光潔開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱中央，以動(dòng)物穿越地面方塊數(shù)為水平運(yùn)動(dòng)得分（四爪均進(jìn)入的方格才計(jì)數(shù)），以直立次數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)得分（兩前爪騰空或攀附周壁），以4min內(nèi)大鼠行為學(xué)得分為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1．3．3強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

在大鼠造模前、造模3周后、給藥8周后在同等條件下進(jìn)行，共3次。取一強(qiáng)迫游泳玻璃缸，加水深30cm左右，水溫穩(wěn)定在室溫，將大鼠輕放水中適應(yīng)2min后連續(xù)觀察4min，以4min內(nèi)大鼠累計(jì)漂浮不動(dòng)時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1．3．4懸尾實(shí)驗(yàn)

在大鼠造模前、造模3周后、給藥8周后在同等條件下進(jìn)行，共3次。將SD大鼠尾端2cm處固定于水平面上，使其呈倒掛狀態(tài)，頭部離臺(tái)面約30cm，四周以板隔離動(dòng)物視線，適應(yīng)2min后觀察4min內(nèi)的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)指標(biāo)為大鼠除呼吸外所有肢體均不動(dòng)）。

1．4血清中甲狀腺激素及細(xì)胞因子含量測(cè)定

大鼠于連續(xù)給藥8周后，采用腹主動(dòng)脈取血5ml，4℃10000r／min離心10min，分離血清，置于－80°冰箱保存待測(cè)，采用ELISA方法檢測(cè)血清中T3、T4、TSH及IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩分析采用LSD檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

20世紀(jì)60年代開始，人們針對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制的中樞神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)，試圖通過(guò)藥物誘發(fā)神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂來(lái)建立相應(yīng)的動(dòng)物模型，主要包括有5-羥色胺酸（5-HTP）誘導(dǎo)甩頭行為、利血平拮抗模型、高劑量阿撲嗎啡拮抗模型等，但藥物誘導(dǎo)的抑郁模型與人類抑郁癥的發(fā)病機(jī)制相差甚遠(yuǎn)，且抑郁癥狀較單一。情志異常是抑郁癥的主要病因，情志病因的實(shí)質(zhì)是不良生活事件形成的心理應(yīng)激，因此用慢性心理應(yīng)激的方法制作抑郁癥模型比較符合臨床實(shí)際，本實(shí)驗(yàn)參考Willner等提出的慢性溫和不可預(yù)見性應(yīng)激程序并加以改進(jìn)，結(jié)合孤養(yǎng)方式構(gòu)建大鼠CUMS抑郁癥模型，這與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激源導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制更接近，糖水消耗是衡量動(dòng)物對(duì)獎(jiǎng)賞的敏感缺乏和快感消失的客觀有效指標(biāo)，抑郁癥臨床表現(xiàn)雖復(fù)雜多樣，但其核心癥狀的實(shí)質(zhì)是快感缺乏，糖水消耗量的減少，不僅較好地模擬人類抑郁癥的核心癥狀，而且操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，較敏感。研究結(jié)果顯示，造模3周后，模型組大鼠糖水消耗量減少，體重增長(zhǎng)緩慢，各種行為出現(xiàn)異常改變，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為CUMS抑郁癥模型造模成功，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。經(jīng)過(guò)抗郁丸連續(xù)8周的治療，抑郁癥大鼠的糖水消耗量增加，體重增長(zhǎng)加快，抑郁行為得以一定改善，說(shuō)明抗郁丸對(duì)CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥大鼠具有一定的抗抑郁功效。甲狀腺功能和抑郁癥的關(guān)系一直受到人們的關(guān)注，但結(jié)論尚不明確。Whybrow等學(xué)者提出甲狀腺功能與抑郁癥有關(guān)，該學(xué)說(shuō)指出甲狀腺功能低下者，血中T3、T4含量下降，可降低抑郁癥發(fā)生的閾值，更易發(fā)生抑郁。陳丹等在探討甲狀腺功能亢進(jìn)與抑郁癥關(guān)系的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，在甲亢初期，T3、T4水平較高時(shí)患者表現(xiàn)為高代謝癥，抑郁癥的發(fā)病率極低，在甲亢的治療過(guò)程中，隨著病情的好轉(zhuǎn)，血清中T3、T4水平下降，抑郁癥的發(fā)病率由6．8％增加至51％，進(jìn)一步治療后，甲狀腺水平正�；蚱�低，甚至出現(xiàn)甲狀腺減退時(shí)，抑郁癥的發(fā)病率超過(guò)50％，表明甲狀腺激素的動(dòng)態(tài)下降參與抑郁癥的形成及病程變化。而趙博等實(shí)驗(yàn)表明抑郁癥大鼠血清T4、TSH呈升高趨勢(shì)；陳寶忠等研究顯示抑郁大鼠T4含量降低，T3、TSH無(wú)明顯差異；佟海英等研究中，抑郁癥大鼠T3含量升高，TSH含量降低；本實(shí)驗(yàn)中模型對(duì)照組大鼠血清中T4、TSH含量降低，抗郁丸可上調(diào)降低的T4、TSH水平。

甲狀腺激素水平與抑郁癥之間不一致的研究結(jié)論，折射出兩者之間復(fù)雜的相關(guān)性，而甲狀腺激素水平高低不一，除了與甲狀腺激素自身的分泌調(diào)節(jié)受多種因素影響相關(guān)外，還可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬和性別、造模刺激方式和強(qiáng)度、造模時(shí)間、采血時(shí)間等因素有一定的關(guān)聯(lián)性。“抑郁癥的細(xì)胞因子假說(shuō)”為探討抑郁癥的機(jī)制和治療抑郁癥提供了一個(gè)新的視角，越來(lái)越多證據(jù)表明細(xì)胞因子和抑郁癥的發(fā)生之間存在密切聯(lián)系。多項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于非抑郁癥患者而言，抑郁癥患者外周血液中炎癥細(xì)胞因子呈高水平過(guò)表達(dá)狀態(tài)，經(jīng)治療后抑郁癥狀緩解時(shí)細(xì)胞因子含量降低趨于正常水平。Wang等研究表明，注射細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑的小鼠出現(xiàn)了體重下降、糖水消耗減少等抑郁樣行為，抗抑郁藥治療后其癥狀明顯好轉(zhuǎn)。Thierno等對(duì)心肌梗死后的抑郁大鼠進(jìn)行治療后，大鼠的抑郁病態(tài)明顯改善，同時(shí)血液中炎性細(xì)胞因子水平下降。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)檢測(cè)模型組抑郁大鼠血清中IL-1β、TNF-α及IL-6含量升高，抗郁丸治療后能有效降低IL-1β、TNF-α及IL-6的過(guò)表達(dá)，改善抑郁行為。細(xì)胞因子在抑郁癥的發(fā)生中可能的機(jī)制為：通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌功能介導(dǎo)、通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)代謝介導(dǎo)、通過(guò)神經(jīng)元細(xì)胞的功能介導(dǎo)。過(guò)度激活的細(xì)胞因子進(jìn)入腦內(nèi)相應(yīng)區(qū)域，造成神經(jīng)內(nèi)分泌功能的紊亂、神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙等一系列異常改變，在抑郁癥的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，抗郁丸能改善CUMS大鼠的抑郁癥狀，逆轉(zhuǎn)甲狀腺激素和細(xì)胞因子的異常水平，提示其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦－垂體－甲狀腺軸分泌功能、調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)從而發(fā)揮抗抑郁功效。