最新生物標志物biomarker檢測技術(shù)進展（四）
全新的SMC單分子檢測技術(shù)
雖然現(xiàn)有多項生物標志物檢測技術(shù)已經(jīng)豐富了人們對生物標志物的認識，獲取了大量數(shù)據(jù)和經(jīng)驗，解決了很多生物學或醫(yī)學問題，但如前文所述的諸多瓶頸仍限制了生物標志物的應(yīng)用。尤其是對于疾病，特別是腫瘤的早期診斷或預(yù)防而言，在疾病的潛伏期或是發(fā)生早期，就能在血清/血漿這樣容易獲得且遠離病灶的樣本中發(fā)現(xiàn)生物標志物的存在十分必要。研究表明這些標志物的含量很可能低至每毫升亞皮克級。上述幾乎所有的技術(shù)對于這一檢測區(qū)間都顯得無能為力。第二，據(jù)文獻報道，在已知的約400,000種人類蛋白中，有大約75%，也就是300,000種被現(xiàn)有技術(shù)很難檢測到。大量生物標志物處在現(xiàn)有技術(shù)的檢測極限之下。第三，現(xiàn)有技術(shù)很多情況下受制于較低的靈敏度，僅能在疾病個體中測得某種生物標志物，而此時疾病可能已經(jīng)進入實際發(fā)生階段。在健康個體或是疾病風險的個體中盡管這些標志物含量極低，但很可能具備預(yù)測性作用，而現(xiàn)有技術(shù)無法有效利用這一點。第四，醫(yī)學研究者在臨床上獲取了各種類型的體液樣本，例如腦脊液、宮頸液、肺泡灌洗液、淚液、尿液等，這些體液樣本中經(jīng)常生物標志物含量極低，但卻具備特定領(lǐng)域的獨特研究價值，而其中蘊含的寶貴生物學信息常被現(xiàn)有技術(shù)忽略。因此，人們亟需開發(fā)更為靈敏且特異的生物標志物檢測技術(shù)來更好地滿足基礎(chǔ)醫(yī)學或轉(zhuǎn)化醫(yī)學的研究需要。
圖5. 單分子檢測技術(shù)原理
新技術(shù)的誕生為這些研究需求的實現(xiàn)提供了重要的機會。單分子檢測技術(shù)（Single Molecule Counting, SMC），在抗體依賴的蛋白生物標志物檢測方面產(chǎn)生了質(zhì)的變化。單分子檢測主流的檢測技術(shù)以Erenna等單分子檢測平臺為代表（也被稱為Singulex），基本原理在于利用毛細管進行熒光素標記分子的上樣，并以激光聚焦的方式進行單個分子的激發(fā)檢測。當熒光素標記分子通過高能量的激光焦點時，單個蛋白分子偶聯(lián)的熒光素所發(fā)射的光閃爍信號被檢測器測得。光閃爍信號的次數(shù)和強度與分子濃度呈正相關(guān)性，從而能建立標準曲線。通過對一定時間之內(nèi)光閃爍信號進行統(tǒng)計，可以對溶液濃度進行定量檢測（圖5）。這項技術(shù)的創(chuàng)始存在一定爭議，有多位學者在同一時期利用單分子檢測技術(shù)對不同分子進行了單分子檢測，并取得了成功。其中代表性的工作包括：1996年，Chen等學者成功進行了藻紅蛋白的單分子檢測；同一年，Craig等學者利用單分子檢測技術(shù)檢測了堿性磷酸酶；1998年，F(xiàn)ister等學者進行了羅丹明6G分子的單分子檢測。[3-5]
針對蛋白生物標志物的檢測，單分子免疫檢測試劑盒仍采用比較典型的雙抗免疫夾心法。與普通ELISA均勻照射96孔板板底的檢測方式不同，SMC技術(shù)試劑盒會將形成雙抗免疫夾心復(fù)合物的分子進行解離，然后利用單分子檢測方法對熒光素標記的二抗進行測定（圖6）。這項技術(shù)最大的優(yōu)勢在于靈敏度顯著提高，在實際工作中經(jīng)常能達到每毫升百分之幾皮克的靈敏度（圖7），大致相當于普通ELISA 1000倍左右的水平。
圖6. 單分子免疫檢測的實驗流程
圖7. 抗體依賴的生物標志物檢測技術(shù)靈敏度對比（引自參考文獻）
相對于前面所綜述的傳統(tǒng)檢測技術(shù)，SMC單分子檢測技術(shù)的應(yīng)用正處于高速發(fā)展階段。盡管行業(yè)內(nèi)普遍看好，但這項技術(shù)為生物標志物檢測帶來的變革仍需時間來證明。該技術(shù)在肌鈣蛋白（Troponin I, cTnI）檢測案例中已經(jīng)展現(xiàn)出非常重要的價值。與傳統(tǒng)技術(shù)僅能檢測心臟疾病個體的cTnI因子不同，這項技術(shù)在健康個體中就可測得痕量的cTnI因子。長達12年的研究結(jié)果展示了令人驚訝的發(fā)現(xiàn)（圖8[6]），健康個體的本底cTnI因子與未來心臟病的累積發(fā)病率呈反比。在另一項高水平的研究報告中，亨廷頓舞蹈病的未發(fā)病個體（突變基因攜帶者）腦脊液中微量的突變型mHTT蛋白可被穩(wěn)定測得，為亨廷頓舞蹈病的診斷和治療提供了全新的方案[8]。
圖8. 單分子檢測技術(shù)對健康個體cTnI的檢測可預(yù)測心臟病累積發(fā)病率
