Brooke M. Koshel和Sean M. McCarthy
沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)

關(guān)鍵詞

方法轉(zhuǎn)換，ACQUITY Arc，IEX，單克隆抗體

應(yīng)用優(yōu)勢

■ 將方法無縫轉(zhuǎn)換至ACQUITY Arc系統(tǒng)，無需改變方法參數(shù)。
■ 利用Arc Multi-flow path™技術(shù)輕松重現(xiàn)HPLC 或UHPLC分離。

沃特世解決方案

ACQUITY^® Arc™系統(tǒng)
2489紫外/可見光(UV/Vis)檢測器
Empower^® 3色譜數(shù)據(jù)軟件(CDS)

簡介

如今，許多暢銷的生物制藥都是蛋白質(zhì)類藥物。與合成小分子藥物的受控化學(xué)工藝不同，生物制劑生產(chǎn)采用的是活細胞，因此更易出現(xiàn)變異。為了確保產(chǎn)品質(zhì)量和安全性，生物制藥的整個生命周期通常需要應(yīng)用多項分析技術(shù)。離子交換色譜(IEX)是一項常用的電荷變體監(jiān)測技術(shù)，它可以反映生物制藥在發(fā)酵、純化和制劑等不同生產(chǎn)階段發(fā)生的各種變化。

ACQUITY Arc系統(tǒng)屬于四元LC 產(chǎn)品組合系列，專為解決分析人員在整個產(chǎn)品測試過程中面臨的結(jié)果一致性問題而設(shè)計。ACQUITY Arc系統(tǒng)采用了Arc Multi-flow path技術(shù)，可輕松重現(xiàn)傳統(tǒng)的HPLC 方法(流路1)，或者將現(xiàn)有方法轉(zhuǎn)換為性能更出色的UHPLC分離方法(流路2)。本應(yīng)用紀要將重點展示如何輕松重現(xiàn)現(xiàn)有的單克隆抗體離子交換分離方法并獲得可重現(xiàn)的結(jié)果。

實驗

LC條件

液相系統(tǒng)統(tǒng)：配備2489紫外可見檢測器ACQUITY Arc系統(tǒng)，流路1
            配備四元泵和DAD檢測器的Agilent 1100系列HPLC 系統(tǒng)
吸收波長：280 nm
采樣速率：20 Hz
色譜柱：Dionex ProPac WCX-10 10 µm，4.0 mm x 250 mm 色譜柱
柱溫：30 ℃
流動相A：0.02 M MES ，pH 6.0
流動相B：0.02 M MES ，0.4 M氯化鈉，pH 6.0
樣品：1 mg/mL 利妥昔單抗，溶解于含0.15 M氯化鈉、0.025 M檸檬酸鈉和0.06% (v/v)吐溫80的溶液中，pH 6.5
樣品溫度：  5 ℃
進樣體積：  40 µL

梯度

數(shù)據(jù)管理

Empower^® 3 CDS軟件，SR2

結(jié)果與討論

ACQUITY Arc系統(tǒng)能夠輕松重現(xiàn)現(xiàn)有的IEX-HPLC方法并且具有出色的重現(xiàn)性

一般而言，分析人員在藥品的整個生命周期中都需要對電荷變體進行監(jiān)測，執(zhí)行嚴格的工藝控制。因此，無論采用何種儀器進行測試，分析人員都必須確定系統(tǒng)間的差異，以便確保產(chǎn)品質(zhì)量。理想情況下，采用的任何系統(tǒng)都必須能夠提供符合產(chǎn)品分析指導(dǎo)原則的一致結(jié)果。為了研究將陽離子交換方法從傳統(tǒng)儀器轉(zhuǎn)換至現(xiàn)代LC 平臺的可行性，我們采用Agilent 1100 系列HPLC 系統(tǒng)分析了利妥昔單抗(一種單克隆抗體)，并將分析結(jié)果與ACQUITY Arc系統(tǒng)的分析結(jié)果進行了比較。所用方法選自USP藥物標準集¹，雖然該方法現(xiàn)已停用，但它仍是該制藥行業(yè)的代表性方法。

我們未對上述方法進行任何修改，直接將其應(yīng)用于Agilent 1100系列HPLC 系統(tǒng)和ACQUITY Arc系統(tǒng)(圖1)。如圖所示，兩個系統(tǒng)的色譜性能幾乎完全一致。如圖1的插圖所示，該方法在兩個平臺間轉(zhuǎn)換時，成功保持了同樣的選擇性和分離度。表1列出了經(jīng)過數(shù)據(jù)處理得到的主峰相對保留時間，以及其它酸性和堿性變體的相對保留時間。雖然分析物在兩個系統(tǒng)上的保留時間之間存在一定差異，但值得注意的是，所有主要色譜峰的相對保留時間基本上是一致的。

我們可通過計算多個參數(shù)來確定分析方法是否符合系統(tǒng)適用性標準，分離度就是其中之一。根據(jù)USP藥物標準集¹的規(guī)定，利妥昔單抗主峰(MP)與賴氨酸變體峰(1B)的分離度不得小于1.5。5次進樣后，Agilent 1100 系列HPLC 系統(tǒng)的平均分離度為1.95 ± 0.02，而ACQUITY Arc系統(tǒng)的平均分離度為2.09 ± 0.02，因此這兩個系統(tǒng)均符合標準。要保證產(chǎn)品一致性，不僅需要系統(tǒng)之間具有重現(xiàn)性，確保同一儀器內(nèi)的重現(xiàn)性也非常重要。圖2展示了在ACQUITY Arc系統(tǒng)上采用上述方法條件，5次重復(fù)進樣利妥昔單抗所得的疊加色譜圖。在整個運行時間范圍內(nèi)，每張色譜圖幾乎完全重疊。插圖中所示的放大色譜圖進一步證實了該結(jié)論。

圖1. IEX 采集數(shù)據(jù)比較，使用A) Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)和B) ACQUITY Arc系統(tǒng)。插圖顯示了酸性和堿性變體的分離情況。利妥昔單抗主峰標示為MP。其它酸性(1A、2A、3A)和堿性(1B 、2B 、3B)殘留物均進行了相應(yīng)標示，并在表1中列出了各自的保留時間。

表1. 在Agilent 1100 系列HPLC 系統(tǒng)和ACQUITY Arc系統(tǒng)上進行IEX分析所得的保留時間比較。酸性和堿性組分的峰標示見圖1。∆值表示兩個系統(tǒng)的相對保留時間之間的差異。所有結(jié)果均為5次進樣的平均值。

表2列出了對圖2中的數(shù)據(jù)進行定量分析的結(jié)果，包括主峰、酸性變體和堿性變體的峰面積百分比，以及將這些值與Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)5次進樣所得數(shù)據(jù)的比較情況。總體而言，兩個系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)相當。兩個系統(tǒng)所得的主峰、酸性變體和堿性變體的峰面積差異分別為0.53%、0.38%和0.90%。

圖2. ACQUITY Arc系統(tǒng)5次進樣的IEX色譜圖的疊加圖。先于主峰洗脫的所有峰均為酸性變體，而在主峰之后洗脫所有峰為堿性變體。從插圖中我們總共可鑒定出3種酸性變體(1A、2A、3A)和3種堿性變體(1B 、2B 、3B)，表2列出了總酸性變體和總堿性變體的匯總結(jié)果。

表2. Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)和ACQUITY Arc系統(tǒng)采集所得的IEX數(shù)據(jù)定量比較結(jié)果。酸性變體和堿性變體包括先于主峰洗脫以及在主峰之后洗脫的所有物質(zhì)。∆值表示兩個系統(tǒng)所得峰面積的差異。所有結(jié)果均為5次進樣的平均值。

結(jié)論

借助Arc Multi-flow path技術(shù)，用戶可利用ACQUITY Arc系統(tǒng)模擬傳統(tǒng)HPLC 方法或?qū)⒎治龇椒ǜ�新為UHPLC分離方法。本應(yīng)用紀要證實，IEX方法能夠從Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)輕松轉(zhuǎn)換至ACQUITY Arc系統(tǒng)(流路1)。在保持所有方法參數(shù)不變的前提下，我們獲得了相對保留時間幾乎完全一致的色譜圖。此外，在ACQUITY Arc系統(tǒng)上進行5次重復(fù)進樣所得的檢測結(jié)果顯示出了極高的重現(xiàn)性。

參考文獻

1. U.S.Pharmacopeial Convention,http://www.usp.org/global/medicines-compendium (accessed March 2015).

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