由于外界創(chuàng)傷引起的異位骨化是一種常見的臨床疾病。研究異位骨化的分子機(jī)制和分子標(biāo)簽有助于異位骨化的早期診斷和臨床治療。來自上海交大附屬第六人民醫(yī)院范存義實(shí)驗(yàn)組的孫仰白博士等人發(fā)表在nature子刊《Scientific reports》上的文獻(xiàn)，向我們闡明了miRNA信號(hào)通路在異位骨化中的作用機(jī)制。

研究背景

外界創(chuàng)傷，手術(shù)或者疾病會(huì)引起軟組織的骨化過程導(dǎo)致異位骨化（Heterptopic ossification HO）。異位骨化可以分為三種不同的類型：進(jìn)行性肌肉骨化癥（FOP），創(chuàng)傷性骨化癥（traumatic HO）和神經(jīng)性骨化癥（neurogenic HO）。然而，目前還沒有一種有效的手段在早期對(duì)異位骨化做出判斷，進(jìn)而為控制骨化過程采取必要措施。因此，研究并尋找異位骨化過程中特異的分子標(biāo)簽，探究其的分子作用機(jī)制顯得格外重要。本研究從miRNA的角度出發(fā)，研究了創(chuàng)傷性異位骨化過程中miR-630的重要調(diào)控作用。

研究結(jié)果 

1.創(chuàng)傷性異位骨化的細(xì)胞來源鑒定
通過免疫組化（IHC）和H&E(hematoxylin-eosin)染色分析創(chuàng)傷后的HO患者骨組織樣本，研究人員對(duì)不同時(shí)期的異位骨化樣本進(jìn)行了鑒定。然后，通過對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞makers vWF，E-cadherin和CD31及成骨marker的免疫熒光雙標(biāo)記，研究人員發(fā)現(xiàn)其在未成熟和成熟的HO細(xì)胞中都有表達(dá)。因此，內(nèi)皮細(xì)胞是異化骨細(xì)胞的來源。

2.異位骨化特異性miRNA篩選
為了尋找表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的異位骨化過程中可能起調(diào)控作用的miRNA，研究人員對(duì)成熟HO階段和非成熟HO階段的病人血清樣本進(jìn)行了全基因組miRNA（該研究中Agilent Human miRNA microarrays (8*60K), 19.0芯片服務(wù)由伯豪生物提供）篩選，發(fā)現(xiàn)了一些上調(diào)與下調(diào)的miRNA。其中，miR-630已有報(bào)道是和EMT轉(zhuǎn)化和軟骨分化相關(guān)。因此，研究人員對(duì)miR-630進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證和分析。結(jié)果顯示，相比于正常人，非成熟HO和成熟HO病人的miR-630分別下降20倍和10倍。所以，miR-630可能是一個(gè)潛在的HO早期診斷marker。

3.內(nèi)皮細(xì)胞HO過程中miR-630的作用
BMP4和TGF-β2是已知的誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EndMT）誘導(dǎo)因子。因此，研人員用這兩個(gè)誘導(dǎo)劑處理，誘導(dǎo)HD-MVECs的EndMT。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)2個(gè)weeks后，miR-630表達(dá)顯著下調(diào)。同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞marker VE-cadherin，occludin下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞marker N-cadherin和vimentin表達(dá)增加。FCM分析也顯示，MSC-like marker CD90和CD44及CD34和CD45表達(dá)也發(fā)生改變。但是，當(dāng)轉(zhuǎn)入miR-630 mimics時(shí)，CD90和CD44又能恢復(fù)。因此，miR-630抑制EndMT過程。Western blot實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證miR-630過表達(dá)時(shí)，VE-cadherin，occludin上調(diào)，N-cadherin和vimentin表達(dá)下調(diào)。

此外，通過對(duì)BMP4和TGF-β2誘導(dǎo)的人HD-MVECs進(jìn)行ALP和alizarin red S染色，研究人員進(jìn)行了成骨細(xì)胞分化檢測(cè)。結(jié)果顯示，miR-630 KD可以顯著增加成骨細(xì)胞分化，上調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)，而miR-630過表達(dá)有相反表現(xiàn)。因此，miR-630抑制HO過程中的骨生成。通過對(duì)誘導(dǎo)HO過程中的小鼠X-ray檢測(cè)也得到了同樣的結(jié)果。射線密度和骨體積分析顯示，過表達(dá)或者KD miR-630可以抑制和促進(jìn)骨密度和體積。因此，該結(jié)果表明，miR-630下調(diào)對(duì)HO相關(guān)的EndMT過程，及MSC-like表型的出現(xiàn)都密切相關(guān)。

4.miR-630作用靶基因鑒定
    既然miR-630調(diào)控HO過程，那么，它的作用靶基因是哪個(gè)呢？通過PicTar和TargetScan預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Slug可能是其靶基因。對(duì)Slug的3’UTR區(qū)進(jìn)行突變，處理miR-630 mimics，報(bào)告激團(tuán)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-630可以顯著降低對(duì)照Slug的表達(dá)。同時(shí)，異位表達(dá)miR-630可以顯著下調(diào)Slug的mRNA和蛋白表達(dá)水平，抑制BMP4和TGF-β2引起的Slug上調(diào)。因此，Slug是miR-630的直接調(diào)控靶基因。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述調(diào)控過程，研究人員進(jìn)行了補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)。過表達(dá)Slug可以顛倒miR-630誘導(dǎo)的內(nèi)皮markers上調(diào)和間葉細(xì)胞marker下調(diào)，補(bǔ)救由于miR-630抑制HO過程中小鼠的后肢礦物沉積。骨密度和體積檢測(cè)也顯示，Slug可以補(bǔ)救miR630的抑制作用，修復(fù)Osteocalcin，osteopontin和Runx2表達(dá)下調(diào)。因此，miR-630對(duì)EndMT的抑制和骨生成抑制是通過直接調(diào)控Slug實(shí)現(xiàn)的。

5.血清中miR-630的表達(dá)是HO診斷的標(biāo)簽
為了探究miR-630的臨床診斷價(jià)值，研究人員對(duì)創(chuàng)傷引起的HO患者和無HO的對(duì)照Ctrl1及骨折愈后患者Ctrl2進(jìn)行血清中miR-630檢測(cè)。結(jié)果顯示，創(chuàng)傷8個(gè)小時(shí)后，miR-630的表達(dá)顯著低于Ctrl1和Ctrl2。出現(xiàn)骨異位，手術(shù)3個(gè)月后，miR-630在HO中顯著減少，術(shù)后1年，在三組病人中已沒有明顯差別。ROC曲線分析顯示，HO病人的AUC相比非HO病人分別為0.892和0.912。分別以1.25作為分界點(diǎn)，HO相對(duì)Ctrl1和Ctrl2的特異性和敏感性都在80%以上，預(yù)測(cè)能力能達(dá)到70%左右。因此，血清中的miR-630表達(dá)可以作為HO的診斷標(biāo)簽。

研究結(jié)果

本研究通過對(duì)HO病人血清miRNA檢測(cè)，找到了HO相關(guān)的特異性miR-630，后期運(yùn)用小鼠模型檢測(cè)驗(yàn)證了其生物學(xué)功能和下調(diào)靶基因Slug。最后，通過對(duì)病人血清的miR-630表達(dá)檢測(cè)和分析，提出來miR-630作為臨床早期診斷的可能性。該研究是一篇集合基礎(chǔ)和臨床運(yùn)用的研究，值得我們廣大科研工作者參考。

原文出處: Sun Y, Cai J, Yu S, Chen S, Li F, Fan C. MiR-630 Inhibits Endothelial-Mesenchymal Transition by Targeting Slug in Traumatic Heterotopic Ossification. Sci Rep.2016,6:22729.