MCMV和SCMV復(fù)合侵染玉米引起玉米組織中siRNAs的積累
RNA沉默是真核生物中調(diào)控基因表達(dá)的一種保守機(jī)制，它在植物生長發(fā)育和抗病毒中發(fā)揮著重要的作用。RNA病毒進(jìn)入寄主植物細(xì)胞后，其復(fù)制中間復(fù)合體和單鏈基因組RNA的高級結(jié)構(gòu)形成的雙鏈RNA可以被寄主植物DCL蛋白識別，加工產(chǎn)生21-24-nt的初級來源于病毒的siRNA（vsiRNA）。初級vsiRNA裝載到特異AGO蛋白中形成RISC復(fù)合體，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則識別其靶標(biāo)并主要以切割的方式降解靶標(biāo)。病毒基因組是vsiRNA最主要的靶標(biāo)，被切割后的病毒RNA可以被RDR識別，并將其加工成雙鏈RNA，再一次被DCL蛋白切割形成次級vsiRNA。初級和次級vsiRNA沒有本質(zhì)上的區(qū)別，都可以作用于靶標(biāo)，發(fā)揮抗病毒的功能。
玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）與侵染玉米的馬鈴薯Y病毒科病毒，如玉米矮花葉病毒（MDMV）、小麥條紋花葉病毒（WSMV）和甘蔗花葉病毒（SCMV），復(fù)合侵染時引起玉米致死性壞死（MLN），對玉米產(chǎn)量造成很大的威脅。雖然有報道稱馬鈴薯Y病毒屬病毒編碼的沉默抑制子HC-Pro可以增加異源病毒的致病性和積累量，并且MCMV與馬鈴薯Y病毒科病毒復(fù)合侵染時積累量顯著增加，但是，關(guān)于它們復(fù)合侵染的機(jī)制研究卻很少。我們準(zhǔn)備以MCMV和SCMV復(fù)合侵染為例，從RNA沉默的角度初步探索其復(fù)合侵染的機(jī)制。
研究思路
為了研究MCMV與SCMV復(fù)合侵染的機(jī)制，我們使用玉米自交系B73作為研究材料，在復(fù)合侵染植物表現(xiàn)壞死癥狀前進(jìn)行系統(tǒng)取樣，提取總RNA后進(jìn)行小RNA高通量測序（該研究中miRNA 測序服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供）。首先從總的小RNA中分離出vsiRNA，然后對vsiRNA特征進(jìn)行分析，初步判定vsiRNA參與復(fù)合侵染時發(fā)揮的作用。
1) vsiRNA尺寸分布可以初步了解哪些DCL參與vsiRNA的形成；
2) vsiRNA正負(fù)鏈來源可以初步了解vsiRNA的來源；
3) vsiRNA 5'末端堿基偏好性可以初步了解vsiRNA可能裝載到哪些AGO蛋白中發(fā)揮作用；
4) vsiRNA正負(fù)鏈上的分布可以進(jìn)一步了解vsiRNA的來源；
5) vsiRNA靶標(biāo)的預(yù)測和分析可以初步了解vsiRNA靶向寄主基因的功能。
結(jié)果分析
1. vsiRNA主要以21-和22-nt為主（圖1），表明玉米DCL4和DCL2參與vsiRNA的形成。SCMV和MCMV復(fù)合侵染（S+M）增加了21-和22-nt M-vsiRNA的積累，影響了S-vsiRNA 21-和22-nt的比例（圖1）。
圖1 vsiRNA的尺寸分布
2. 來源于MCMV基因組正鏈的vsiRNA較多，來源于SCMV基因組正負(fù)鏈的vsiRNA比例基本相同（圖2）。
圖2 vsiRNA正負(fù)鏈偏好性
3. vsiRNA 5'末端主要以A為主（圖3），表明vsiRNA可能裝載到玉米AGO2中發(fā)揮作用。
圖3 vsiRNA 5'末端堿基偏好性
4. vsiRNA在MCMV和SCMV基因組正負(fù)鏈上幾乎連續(xù)分布，但這種分布又有差異，產(chǎn)生很多hotspot區(qū)（圖4）。
圖4 vsiRNA在病毒基因組上的分布
A：MCMV基因組簡圖。B：SCMV基因組簡圖。C和E分別是MCMV和S+M侵染中21-和22-nt M-vsiRNA在MCMV基因組正負(fù)鏈上的分布。D和F分別是SCMV和S+M侵染中21-和22-nt S-vsiRNA在SCMV基因組正負(fù)鏈上的分布。X軸上方表示來源于正鏈的vsiRNA起始位置，下方表示來源于負(fù)鏈的vsiRNA終止位置。
5. 我們將來源于MCMV和SCMV正負(fù)鏈上read數(shù)前50的vsiRNA進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，預(yù)測得到的靶標(biāo)很多，我們將得分不低于170的進(jìn)行了GO和KEGG分析（圖5和圖6）。
圖5 玉米中vsiRNA預(yù)測靶標(biāo)基因的GO注釋分析
圖6玉米中vsiRNA預(yù)測靶標(biāo)的KEGG分析
I: Metabolism; II: Genetic Information Processing; III: Environmental Information Processing; IV: Cellular Processes; V: Organismal Systems; VI: Human Diseases.
原文出處：
Xia Z, Zhao Z, Chen L, Li M, Zhou T, Deng C, Zhou Q, Fan Z. Synergistic infection of two viruses MCMV and SCMV increases the accumulations of both MCMV and MCMV-derived siRNAs in maize. Sci Rep. 2016 Feb
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