Figure 2. CRISPR/Cas9mediated genome editing by electroporation. (b)Examples of embryos from the three classes that exhibited different limb phenotypes: no limbs (type I), limb defects (type II, left hind limb deficiency, right: truncated fore-and hind-limb) , and normal (type III).(c)Graph summarizing the effects of Cas9 and gRNA electro-poration on limb development. The concentrations of RNAs used in each experiment are shown at left. The numbers in each column are the number of embryos exhibiting the phe-notype in each category.

為了確定基因組編輯的高效，轉(zhuǎn)染mCherry入11只小鼠中，發(fā)現(xiàn)所有11個(gè)小鼠都沒有紅色熒光（圖3b）。這一結(jié)果說明電轉(zhuǎn)染的方法還可以用于高效產(chǎn)生HDR介導(dǎo)的基因敲除小鼠。

接下來，我們揭示了這種突變是否會在下一代中遺傳下來。電轉(zhuǎn)200ng/ul Cas9 mRNA和100ng/ul的gRNA入卵細(xì)胞，靶向mCherry基因。觀察25只F0代小鼠，均無紅色熒光表達(dá)。而且所有的F1代小鼠同樣沒有紅色熒光，而且mCherry基因被打斷。說明基因編輯突變體可以穩(wěn)定遺傳。

討論

綜上所述，我們確立了一個(gè)電轉(zhuǎn)條件，保證基于CRISPR/Cas9的基因組編輯的高效和高存活率。因?yàn)殡娹D(zhuǎn)染不需要微注射技術(shù)，而且可以同時(shí)對40-50個(gè)胚胎進(jìn)行處理，這種方法較之以前的方法能更快更簡單的得到大量的穩(wěn)定遺傳突變體小鼠。應(yīng)用這個(gè)方法，可以為分析F0表型進(jìn)而篩選發(fā)育相關(guān)重要基因奠定基礎(chǔ)。