雙色同步成像在熒光共定位等成像實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用
熒光的共定位是當(dāng)今生物顯微成像中一個極為常見的技術(shù)，兩個或者更多種不同顏色的熒光探針被用來標(biāo)記不同的結(jié)構(gòu)/位點(diǎn)，使得其相互關(guān)系得以明晰地在合并的圖像上展現(xiàn)。隨著研究者對于實(shí)驗(yàn)的要求越來越高，這些熒光共定位的成像逐漸被希望能用于熒光強(qiáng)度高速變化或者樣品本身位置不斷變化的實(shí)驗(yàn)中，比如活動的斑馬魚、線蟲體內(nèi)兩類神經(jīng)細(xì)胞的熒光共定位成像。在這些實(shí)驗(yàn)中，由于樣品本身是運(yùn)動的，兩個顏色的成像時間間隔越短，越能夠反映熒光探針共定位的真實(shí)情況。
在另外一些實(shí)驗(yàn)中，同一個熒光探針的熒光顏色(波長)會隨著環(huán)境的變化而發(fā)生變化，那么前后兩種顏色熒光強(qiáng)度的比值就能反映出環(huán)境的變化，如Di4之于細(xì)胞膜電位，Cameleon之于Ca離子濃度等等。當(dāng)相關(guān)的環(huán)境變化速度比較快的時候，兩個顏色的成像時間間隔越短，測量也就越精確。
綜合以上兩類成像實(shí)驗(yàn)，均是需要盡可能地將兩個不同顏色熒光信號在同一時刻拍攝下來，那么最理想的情況就是我們在這篇Application notes中所提到的雙色同步成像，即完全同時地拍攝兩個顏色通道的熒光信號。
雙色同步成像——采用W-View GEMINI的完全同步成像
雙色同步成像最直接的思路就是用彩色相機(jī)，但如今絕大多數(shù)的彩色相機(jī)是在黑白芯片的基礎(chǔ)上將每個像素前添加濾光涂層（一般為紅、綠、藍(lán)三種，如下圖），此彩色濾光涂層使得不同的像素可以分別得到不同的顏色信息，最后合成出彩色的圖片。這樣的設(shè)計在明場成像（如HE染色，免疫組化切片）中不可或缺，但對于生物熒光信號的成像卻是有缺陷的。首先，濾光涂層的出現(xiàn)會吸收或反射部分入射光信號，降低整個芯片的靈敏度，在信號本來就較弱的熒光拍攝中會影響到成像信噪比；其次，由于不同像素前存在不同顏色的濾光涂層，對于單色光信號——比如熒光信號——的實(shí)際分辨率將被降低。換句話說，對于一臺140萬像素的彩色CCD相機(jī)，其真正能夠檢測到綠色熒光信號的像素僅有約70萬個像素，其余的70萬像素的綠光強(qiáng)度信息均為計算獲得（注：因?yàn)榫G色為人眼最為敏感的顏色，所以一般彩色相機(jī)中以4個像素為一組，兩個像素采用綠色涂層，其余兩個像素則分別采用藍(lán)色及紅色涂層）。更重要的，如果采用這類彩色相機(jī)用于雙色熒光同步成像，一些顏色并不是紅綠藍(lán)三種顏色（對應(yīng)彩色相機(jī)像素上的三種濾光涂層）的熒光探針將受到極大的限制。
所以傳統(tǒng)上，許多實(shí)驗(yàn)室通過切換顯微鏡上的濾光塊轉(zhuǎn)盤或者是采用濾光輪進(jìn)行不同顏色之間的切換。但這樣無法做到完全同步拍攝兩個顏色的圖片，濾光塊轉(zhuǎn)盤的切換時間需要約1秒鐘，而濾光輪不同濾光片之間的每一次切換也需要幾十毫秒時間，事實(shí)上影響了實(shí)驗(yàn)的時間分辨率，所以在比較高速的比例成像等場合，采用濾光輪或者濾光塊轉(zhuǎn)盤都容易造成數(shù)據(jù)的誤差（舉例計算請參考下面所示的“應(yīng)用實(shí)例1”）。
而采用濱松W-View GEMINI則完全沒有這樣的擔(dān)心，兩個顏色的信號被成像到相機(jī)的上下兩半感光芯片上，實(shí)現(xiàn)了兩個顏色成像的完全同步。
雙色同步成像——一臺Flash 4.0 LT相機(jī)作兩臺用
采用W-View GEMINI這樣的雙色分光附件將兩種顏色的信號成像到一臺相機(jī)的一個感光芯片上很好地解決了同步成像的時間問題，但對于絕大多數(shù)的相機(jī)，整個感光芯片只能設(shè)置一個曝光時間，當(dāng)兩個顏色的信號強(qiáng)度相差較大時將很難同時將兩個顏色的成像信噪比保證在最佳狀態(tài)。
而濱松Flash 4.0 LT則可以分別調(diào)整同一芯片上下兩半的曝光時間。所以在采用W-View GEMINI配合Flash 4.0 LT的時候，我們可以非常靈活地調(diào)整兩個顏色信號的相對亮度，得到更加能夠突出所需信號和結(jié)構(gòu)的圖片。在兩個顏色通道的信號差別非常大的時候，Flash 4.0 LT + W-View GEMINI這種靈活的曝光時間設(shè)置就可以針對不同的波長設(shè)置不同的曝光時間，同時保證兩個波長信號的信噪比。
W-View GEMINI應(yīng)用實(shí)例1——表達(dá)Cameleon (YC3.60)的HeLa細(xì)胞在收到組胺刺激時的高速鈣離子成像
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物鏡：100x，NA 1.49 |
幀速：33.3 幀/秒 |
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相機(jī)：濱松ImageEM X2 EMCCD |
曝光時間：30 ms |
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附件：濱松W-View GEMINI |
增益：1200x |
在細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度高速變化的場合下，雙色同步成像可以保證數(shù)據(jù)的高速采集。以這個實(shí)驗(yàn)為例，YC3.60的分子中包含CFP、YFP兩個部分，沒有鈣離子結(jié)合時，兩個部分距離較遠(yuǎn)，用430nm的光激發(fā)時得到的是CFP所發(fā)射的480nm的青色信號；當(dāng)結(jié)合了鈣離子之后，YC3.60中CFP和YFP兩個部分在分子中會挨到一塊兒，符合CFP-YPF發(fā)生FRET的條件，430nm激發(fā)光照射時，能量將由CFP轉(zhuǎn)移至YFP，發(fā)射出535nm的黃色熒光信號。所以通過實(shí)時檢測480nm和535nm的信號強(qiáng)度比值就可以監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。
如果采用濾光輪，假設(shè)不同濾光片位置的切換時間為30ms（這已經(jīng)是比較出色的產(chǎn)品了），CFP和YFP各自需要30ms曝光時間，一個數(shù)據(jù)點(diǎn)需要切換兩次濾光片位置（如從CFP切換到YFP然后還得切換回來預(yù)備下一個數(shù)據(jù)點(diǎn)的采像），所以總共需要120ms來采集一個數(shù)據(jù)點(diǎn)，結(jié)果就是當(dāng)我們采用濾光輪的配置時每秒鐘我們只能得到8-9個數(shù)據(jù)點(diǎn)（鈣離子濃度數(shù)據(jù)）。
而采用W-View GEMINI時，30ms的曝光時間內(nèi)就可以同時采集到CFP和YFP的熒光信號，而且沒有顏色切換的時間損失，最終保證了33幀/秒的高速成像，也就是說，每秒鐘我們可以得到33個鈣離子濃度數(shù)據(jù)點(diǎn)。
兩種方法在動力學(xué)上的表現(xiàn)高下立判。
W-View GEMINI應(yīng)用實(shí)例2——采用Di-4-ANEPPS對hiPS-心肌細(xì)胞的膜電位變化進(jìn)行成像
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物鏡：100x，NA 1.49 |
幀速：100 幀/秒 |
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相機(jī)：濱松Flash 4.0 V2 sCMOS |
曝光時間：10 ms |
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附件：濱松W-View GEMINI |
發(fā)射波長：525/50 nm & 630/92 nm |
對于樣品有位置移動的情況下，雙色同步成像可以抵消樣品位置變化所造成的誤差。
比如這個例子中的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞，我們需要通過Di-4-ANEPPS這個染料對其膜動作電位進(jìn)行成像。Di-4-ANEPPS這種熒光染料通過藍(lán)光（~488nm）激發(fā)，其發(fā)射波長卻會根據(jù)膜電位而有所變化，通過計算細(xì)胞不同區(qū)域內(nèi)525nm/630nm的比值就可以得到此區(qū)域內(nèi)膜電位的變化。這種成像方法相相對膜片鉗等電生理方法而言，可以得到細(xì)胞任意位置的膜電位變化，空間分辨率更高。而W-View GEMINI雙色分光附件以及高速高靈敏度的Flash 4.0 sCMOS相機(jī)的應(yīng)用也保證了其極高的時間分辨率（每秒100個數(shù)據(jù)點(diǎn)），使得我們可以對細(xì)胞任意位置的動作電位進(jìn)行時間空間都非常精確的測量。
W-View GEMINI應(yīng)用實(shí)例3——線蟲鹽敏感（salt-sensing）神經(jīng)元在NaCl濃度變化時響應(yīng)的時空關(guān)系分析
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物鏡：60x，oil |
幀速：30 幀/秒 |
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相機(jī)：濱松Flash 4.0 LT |
曝光時間：33 ms |
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附件：濱松W-View GEMINI |
探針：ASER-R-GECO1_AIY-G-GECO1.2 |
在這個例子中，為了監(jiān)測ASER和AIY兩個神經(jīng)元在外界NaCl濃度變化時的表現(xiàn)，研究者分別在兩個神經(jīng)元上表達(dá)標(biāo)記了紅色和綠色的鈣離子敏感熒光蛋白R-GECO1與G-GECO1.2，然后讓環(huán)境中的NaCl濃度以10秒為周期在0mM和50mM之間切換。通過分析兩個神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的濃度變化，可以看出兩個神經(jīng)細(xì)胞兩者在NaCl不同濃度下的相反表現(xiàn)。
擴(kuò)展閱讀：GCaMP鈣離子成像中，視網(wǎng)膜上兩個神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)出相反的鈣離子濃度變化（A濃度高的時候B濃度低，B濃度變高時A濃度下降），如何采用Reslice方法在平面圖中反映出這種關(guān)系，敬請參閱鏈接中文章第14-16步：點(diǎn)擊進(jìn)入了解>>
W-View GEMINI應(yīng)用實(shí)例4——心肌細(xì)胞搏動時鈣離子濃度的變化與細(xì)胞收縮在時間上的先后分析
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相機(jī)：濱松Flash 4.0 V2 |
物鏡：40x，NA 0.6 |
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附件：濱松W-View GEMINI |
曝光時間：30 ms |
除了兩個不同顏色的熒光同步成像之外，W-View GEMINI還可以用于熒光和明場的同步成像。在這個例子中，研究者同步拍攝監(jiān)測了心肌細(xì)胞波動時的鈣離子濃度變化以及細(xì)胞收縮的情況。藍(lán)光激發(fā)發(fā)綠色熒光的Fluo-8被用于鈣離子濃度的監(jiān)測，而明場的相差（phase contrast）成像則是采用了600-680nm的紅光。通過對單個細(xì)胞中鈣離子濃度和相差圖像的分析，可以看出鈣離子的濃度上升是稍稍領(lǐng)先于心肌細(xì)胞的收縮的。
這一類實(shí)驗(yàn)中，明場透射光的信號是比熒光信號強(qiáng)很多的，除了可以在明場透射光光路中加入減光片將兩個信號調(diào)整得差不多之外，更方便的方法是利用Flash 4.0 LT可以針對芯片兩半分別調(diào)整曝光時間的特點(diǎn)進(jìn)行更加靈活的調(diào)整（參考本文相關(guān)段落：雙色同步成像——一臺Flash 4.0 LT相機(jī)作兩臺用）。
W-View GEMINI應(yīng)用實(shí)例5——斑馬魚雙色雙光子lightsheet成像
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相機(jī)：濱松Flash 4.0 V2 |
附件：濱松W-View GEMINI |
在國內(nèi)，北京大學(xué)的研究者也采用W-View GEMINI在他們自己設(shè)計搭建的雙色雙光子lightsheet成像系統(tǒng)中。系統(tǒng)采用兩臺飛秒激光器作為光源分別雙光子激發(fā)兩個顏色的熒光探針，進(jìn)行雙色的3維lightsheet成像。樣品是3天大小的斑馬魚，紅色和綠色的熒光探針分別標(biāo)記著紅細(xì)胞和胰島細(xì)胞，為了能夠盡可能縮短3維圖像的采集時間，以防紅細(xì)胞在血管中的移動影響成像質(zhì)量，系統(tǒng)中采用了W-View GEMINI進(jìn)行了雙色的分光，讓Flash 4.0 V2相機(jī)同步對紅細(xì)胞和胰島細(xì)胞進(jìn)行成像。
http://v.youku.com/v_show/id_XMTI3NjQzMjA1Mg==.html
更多雙色同步成像的文獻(xiàn)與應(yīng)用實(shí)例
1. 單分子多色FRET，采用濱松Flash 4.0 & W-View GEMINI，通過cy3/cy5/cy7的組合分析核糖體與tRNA的相互作用：
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-10°/-30°深制冷且>70%QE的 高速高靈敏度sCMOS |
>70%QE的 高速高靈敏度sCMOS |
業(yè)界幀速最高（70fps @ 512x512）的背照式EMCCD |
雙色分光附件 |
標(biāo)簽：
熒光探針;顯微成像;雙色同步成像;熒光共定位
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