Fura-2 QBT試劑盒——新型鈞相Fura-2鈣流檢測實(shí)驗(yàn)

Fura-2 染料一直以來被認(rèn)為是在細(xì)胞成像、GPCR 介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣流、以及離子通道激活等實(shí)驗(yàn)中檢測鈣動(dòng)員的重要工具。這種比值法檢測染料通過計(jì)算結(jié)合和未結(jié)合兩種狀態(tài)之間的熒光強(qiáng)度比值，有助于糾正由于染料添加或細(xì)胞鋪板造成的誤差。然而，傳統(tǒng)的Fura-2 染料必須要進(jìn)行緩沖液清洗，從而對(duì)于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)來說都提高孔間差異性并需要耗費(fèi)更多時(shí)間且增加操作復(fù)雜性。

 Molecular Devices®推出的Fura-2 QBT™鈣流試劑盒是基于專利的信號(hào)湮滅技術(shù)，含有比值法檢測的Fura-2 鈣離子指示劑，提供均相實(shí)驗(yàn)體系并減小細(xì)胞基礎(chǔ)的差異性, 從而通過在檢測前去除細(xì)胞清洗步驟間接增加通量。另外, Fura-2 QBT.鈣流試劑盒是在紫外光譜處激發(fā)，最大程度使得研究者可以減少488nm激發(fā)的化合物熒光信號(hào)的干擾。

特點(diǎn)：

基于信號(hào)湮滅技術(shù)，獲得更大信號(hào)窗口

免洗和比值法信號(hào)檢測使得實(shí)驗(yàn)差異性降至最低

免洗步驟節(jié)省了時(shí)間和實(shí)驗(yàn)成本

實(shí)驗(yàn)原理

Fura-2 AM 是一種鈣離子敏感染料，在340 nm 和380 nm 被激發(fā)，發(fā)射波長是510 nm。染料結(jié)合了鈣離子后其吸收波長從380nm 轉(zhuǎn)移到340nm。圖1 顯示了鈣離子結(jié)合Fura-2 后340/510nm 發(fā)射的信號(hào)（綠）的增加，而380/510 nm 發(fā)射的信號(hào)（橙）下降。計(jì)算兩種發(fā)射的信號(hào)比值（插圖）來檢測用于擬合量效曲線的最大值減去最小值后的信號(hào)效應(yīng)。

Fura-2 QBT.鈣流實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

本次實(shí)驗(yàn)中使用的是小規(guī)格的Fura-2 QBT.鈣流試劑盒（PN #R8197）。染料重懸在含有20 mM

HEPES 的 Hank’s 平衡鹽溶液（HBSS）。 丙磺舒（PBX）在需要時(shí)加入，用以抑制染料被轉(zhuǎn)移出細(xì)胞內(nèi)。貼別的CHO M1 細(xì)胞或HeLa 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前過夜種在黑壁底透的384 孔板中，在試驗(yàn)時(shí)從培養(yǎng)箱中取出。含有Fura-2 QBT 染料或者其它染料的25μL 緩沖液加入到每個(gè)孔中，同時(shí)孔中需含有25μL 緩沖液或培養(yǎng)基。加載了Fura-2 QBT.鈣流試劑（PN #R8197）或BD 比值法鈣流試劑（#644243）的細(xì)胞記錄板在37°C、5%CO2 孵育一小時(shí)。為便于對(duì)比，采用了傳統(tǒng)的Fura-2 清洗方法。

按照此傳統(tǒng)的Fura-2 清洗方法，在加入50μL 的1X 染料緩沖液之前去除每個(gè)孔中的培養(yǎng)基，然后去其它試劑盒一樣細(xì)胞記錄版在同樣的條件和時(shí)間下進(jìn)行孵育。在FlexStation®3 微孔讀板機(jī)或FLIPR® Tetra 系統(tǒng)上開始記錄前，所有記錄板從培養(yǎng)箱中取出并降溫至室溫10 分鐘。采用了傳統(tǒng)Fura-2 清洗方法的記錄板需要在開始記錄前用HBSS 實(shí)驗(yàn)緩沖液清洗3 次以去除多余的染料。

FlexStation 3 和FLIPR Tetra 系統(tǒng)上的比值法鈣流檢測實(shí)驗(yàn)在384 孔的聚丙烯化合物板中將5 倍濃度的相應(yīng)配體溶于含20mMHEPES 的HBSS 緩沖液中。在FlexStation3（圖2）或FLIPRTetra系統(tǒng)（圖3）檢測過程中加入激動(dòng)劑，儀器參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化以適應(yīng)于比值法檢測實(shí)驗(yàn)。染料的激發(fā)波長是340nm和380nm。在510 nm 檢測到發(fā)射信號(hào)，每個(gè)孔中兩個(gè)激發(fā)波長下的相對(duì)熒光單位（RFU）的記錄持續(xù)大約90 秒，包括加樣前和加樣后。實(shí)驗(yàn)中每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的計(jì)算后的輸出結(jié)果是340nm 與380nm 波長信號(hào)的比值。最大值減去最小值的計(jì)算來源自比值信號(hào)曲線。量效曲線和EC50/IC50 濃度統(tǒng)計(jì)計(jì)算所需的數(shù)據(jù)從ScreenWorks®或SoftMax® Pro軟件中輸出， 然后用GraphPad Prism 進(jìn)一步擬合和計(jì)算。 根據(jù)Zhang, et. al 發(fā)表的方法進(jìn)行.Z值的計(jì)算。

結(jié)果

結(jié)論

相對(duì)于傳統(tǒng)Fura-2 實(shí)驗(yàn)，Fura-2 QBT.鈣流試劑盒提供了均相的實(shí)驗(yàn)體系，通過使用Molecular Devices 公司基于信號(hào)湮滅的專利技術(shù)無需再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗。因此將提高通量、減小細(xì)胞鋪板或沖洗時(shí)細(xì)胞丟失等造成的實(shí)驗(yàn)差異性，并節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本（因?yàn)椴町愋远�需要重�?fù)實(shí)驗(yàn)帶來的緩沖液和耗材）。相比于BD 比值法鈣流試劑盒（#644243）傳統(tǒng)的Fura-2 細(xì)胞沖洗實(shí)驗(yàn)，Fura-2 QBT.鈣流試劑盒可得到最大的信號(hào)窗口以及在EC80 或IC80 下最好的Z 值。因?yàn)?/SPAN>Fura-2 燃料在紫外范圍激發(fā)，從而避免了化合物488nm 激發(fā)的自發(fā)熒光的干擾。Fura-2 QBT.鈣流試劑盒在FLIPRTetra 系統(tǒng)和FlexStation 3 微孔板檢測平臺(tái)上進(jìn)行了充分的驗(yàn)證，提供了可重復(fù)、可量化操作的解決方案，適合于高通量的篩選工作。