BioTNT PCR Array實驗操作介紹
一．用戶需要自備的材料和儀器
Biotnt First Strand cDNA Synthesis Kit：A2010B0B03 ；
Biotnt qPCR Premix Kit： A2010A0112；
RNA 抽提：推薦使用Qiagen RNeasy Mini Kit (50) 74104，RNase-Free DNase Set (50)，79254
DNase/RNase free槍頭，PCR反應管，1.5 mL離心管
10 μL到1,000 μL可調節(jié)單通道微量移液器以及適配的槍頭
5 μL到20 μL可調節(jié)多通道微量移液器以及適配的一次性槍頭
定量qPCR儀器
384 微孔板排列（24*16）：每塊板分為四個區(qū)，不同區(qū)內可以加入不同的樣本；
二．實驗步驟：
2.1 實驗前準備
注意事項：
1. 開始實驗前請仔細閱讀產品使用手冊。注意：請確認qPCR array 與您的qPCR儀器匹配；
2. 嚴格按照QPCR標準步驟操作，采用以上推薦試劑盒進行抽提mRNA，注意去除基因組污染；避免核酸污染和非特異性擴增。
RNA 定量與質量控制
A. 使用無菌水(RNase-free)稀釋 RNA 樣本，檢測 260 nm 和 280 nm 吸光值，A260/280 應大于 1.8。
B. 使用公式A260× 40 ×稀釋倍數 = XXXXμg/mL 計算 RNA 濃度。
C. 使用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 完整性。
D. 建議：RNA 質量測定后，逆轉錄得到CDNA，建議用多個內參基因自行驗證CDNA 質量；
3. 基因組DNA污染控制
每個Array板塊上的GDC(Genomic DNA Control)反應孔專為檢測每個樣品進行qPCR反應時可能存在的基因組DNA污染而設置。如果該反應孔的CT值小于35，則表明存在可檢測到的基因組DNA污染，應采取措施予以解決。因此，必須從RNA樣品中去除基因組和其他全部殘余污染物。建議采用Qiagen 柱式抽提過程中加入DNAse去除基因組污染。
4. RNA 含量調平：實驗樣本的RNA 盡量調到同一水平；加入RNA 酶free的水，調整RNA 濃度；
預計每個樣本需要的 RNA 量和RT-PCR反應數(逆轉錄CDNA；采用逆轉錄試劑盒進行，每個樣本準備100ul的CDNA)；
2.2 PCR-Array 實驗步驟：
1． 從-20度冰箱拿出PCR Array，平衡到室溫后拆開自封袋，取出PCR Array的384板；
2． 融解并充分混勻BioTNT QPCR 染料法premix，短暫離心使管中試劑處于底部，冰上保存。（一塊384板需要使用4.4 ml premix）；
3． 去除積存在封閉反應板表面的冷凝物。小心撕去板上的密封膜。
4． 樣本加樣，進行QPCR 實驗；配制過程在冰上操作。
qPCR array 可對同一樣本中多個基因同時進行檢測，為了充分滿足實驗需要以及避免實驗操作產生的損耗，在配制qPCR反應液時需要比實際體積多出 10%。
充分混勻qPCR反應液，短暫離心。每個反應孔精確加入 20 μl 反應液。每次加樣都需要換用新的槍頭以避免交叉污染。
準備PCR 混合物：樣本1準備100ul CDNA，加入1ml PCR 水和1ml premix（采用BioTNT premix，貨號：A2010A0112），混合。
區(qū)一有96孔，樣本一的混合物每孔加入混合物20ul；
同理，樣本2的混合物加入區(qū)二的96孔中，每孔加入混合物20ul；
同理，樣本3的混合物加入區(qū)二的96孔中，每孔加入混合物20ul；
同理，樣本4的混合物加入區(qū)二的96孔中，每孔加入混合物20ul；
5． 使用產品包裝中的新密封膜覆蓋qPCR反應板，確保密封膜粘貼平整和緊密以防止光線折射和蒸發(fā)損耗。把384板放入板式離心機，2000rpm 離心2分鐘；去除氣泡。
6． 開始qPCR反應，推薦使用下表中兩步法qPCR反應程序。當使用SYBR Green 染料監(jiān)測qPCR反應時，需要在qPCR循環(huán)結束后立即進行溶解曲線分析。
【擴增條件】
以ABI 7900，7900，ViiA7(384 well block)為例，Detector設為SYBR, QUENCHER設為NONE,
95℃ 5分鐘→95℃ 5秒→60℃ 30秒（讀板）→溶解曲線分析
40個循環(huán)
三、數據導出后進行分析；
3.1 數據分析
基本設置
1. 確定基線
基線是qPCR擴增前期的熒光本底信號，一般都由儀器自動設置。不同儀器類型，基線的設置也略有不同，往往在熒光信號指數擴增階段的前幾個循環(huán)處，一般將定量PCR的前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號，如果實驗數據中最低CT還小于基線的設置上限，研究人員則需要手動設置。其設置原則為：起始值設置為2或3，終止值的設置為整個反應板中擴增最強檢測因子的CT值減去2或3所得的值即可，一般設置在2-10的范圍內，不要超過15。
2. 設定閾值
熒光閾值的正確設置是進行數據分析的關鍵一步，熒光閾值的設置往往在熒光信號指數擴增的起始階段。一般情況下，內參基因的表達水平往往高于大多數的檢測基因。
3. CT值的獲得
所謂CT值就是在熒光PCR擴增過程中，當擴增產物的熒光信號達到設定的閾值（Threshold）時所經過的擴增循環(huán)次數（cycle），被稱為CT值。
4. 多數的定量PCR儀是以Excel的形式導出CT值。
5. 選取合適的內參基因，用ΔΔCT數據分析方法對定量PCR結果進行相對定量分析。
6. 所有CT值大于35或顯示N/A，均認為沒有檢測到該基因的表達。計算時按照CT值為35進行計算。
3.2 質量控制：
1. 通過定量PCR儀器分析軟件檢查每個檢測基因的擴增曲線及融解曲線，每個內參基因、目的基因PCR的融解曲線均特異性的顯示單峰。
2. PTC（陽性對照）反應孔，從融解曲線上分析均呈單一銳鋒，從擴增曲線上分析，CT值介于17～23之間。
3. RTC（spike-in反轉錄對照）反應孔，從融解曲線上分析均呈單一銳鋒，從擴增曲線上分析，CT值介于17～23之間。
3. 檢查GDC(基因組DNA污染)反應孔的CT值。如果GDC反應孔CT值大于35，表明樣本中存
在的少量基因組DNA污染不會影響基因表達定量檢測結果。
4. RTC和 PTC的三重復CT 值應比較接近，說明實驗重復性好。
3.3數據分析
下載數據分析系統(tǒng) (http://www.biotnt.com)進行數據分析。此數據分析系統(tǒng)采用ΔΔCt 法來實現 fold-change 分析或基因的表達量水平(CT值)統(tǒng)計學分析。
1. 在開始分析前請下載并閱讀“Biotnt Array數據分析操作指南”。
2. 將CT值輸入相應的數據分析模板(Sample Data.xls和 Control Data.xls)，選擇合適的參照和分析參數。
注意：被選作采用ΔΔCt 法對qPCR Primer Array標準化的參數必須不受實驗設計影響。
因此需采用一個或多個已經過實驗確證的參數。參數的單個CT值或平均值可用于標準化實驗。
3. 完成指定分析。實驗重復至少3次后會得到統(tǒng)計數值(p值)。通過分析數據結果即可簡便快捷的篩選出您感興趣的基因，便于以后的研究。
使用限制
以下條款適用于BioTNT QPCR Array產品。產品購買者需遵守最終用戶限制許可條例。本產品僅限購買者內部研究使用，不得使用于人體或診斷、治療。未經BioTNT 事先書面同意，本產品不得轉售，不得重新包裝或修改后轉售，不得用于生產商用產品。
質量保證
BioTNT保證產品與產品數據表中描述的規(guī)格保持一致。
若經BioTNT證實產品未達到規(guī)格要求，BioTNT 將為您替換此產品。若無法替換，BioTNT將退款給購買者。此質量保證僅適用于最初產品購買者。
BioTNT僅負責替換產品或退還實際的購買金額。對于由使用或不正確使用產品產生的損害或使用其他相關材料和試劑產生的損耗，BioTNT不承擔責任。BioTNT不提供任何形式的明示的或者默示的保證，包括對適銷性、適用于特定用途的默示保證。
BioTNT致力于為消費者提供高質量的研究產品。如果您對BioTNT的產品有任何問題或疑慮，請撥打電話4008801880聯(lián)系。
標簽：
PCR Array
